渗透型冰冻保护剂.ppt

第九章 植物种质资源离体超低温保存 种质资源保存：利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 种质资源超低温保存（Cryopreservation）是将植物的细胞或组织经过防冻处理后，在－80℃以下的超低温下保存的方法 极端低温下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。同时由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程多大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料 意义 可以在有限空间内保存大量资源 与种子保存相比，可以不受时间和高含水量的限制 与试管苗相比，可以避免频繁继代而带来的变异，同时节省工作量 用于离体保存的植物材料 愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等 超低温保存的植物种类 超低温保存已涉及到很多植物种类（谷类、豆类、薯类、树木、藻类等等） 据王君晖等（1998）统计，目前已有40多个属60多个种的木本植物被进行了超低温保存试验 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的稳定，适用于对植物材料进行短、中、长期保存，使迄今唯一的、不需要继代的、可靠的长期保存方法。 随着保存技术的发展，运用复合程序的超低温保存技术不断涌现，对一些体积较大的组织进行保存将成为可能，且保存过程对材料的伤害越来越小。因此，超低温保存技术为种植资源保存提供了一条新的途径。 植物细胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易冻结 理论上讲，细胞外水的冻结温度为－5 ℃ ～－15 ℃，细胞内游离水的冻结在－25 ℃，而结合水在－100 ℃下也不会冻结 根据Luyet的冻结理论，细胞内游离水的冻结温度可以认为是细胞冻存的安全温度，一般将－30 ℃视为一些技术研究的基础温度 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 根据细胞内外水的冻结特性选择冻存技术 逐步冷冻：在细胞中游离水冻结之前，首先使胞外冻结，从而导致细胞内游离水向胞外渗溢使细胞适度脱水，因为适度的细胞内脱水对冻存是有益的 快速冷冻：即玻璃化冻存技术，提高保护剂浓度加快降温速度，使细胞内水冻结冰晶体积非常小，出现玻璃状的冻结现象，从而也可使细胞免受伤害，达到细胞冻存的目的 细胞超低温贮存一般要经过： 预冻→超低温长期储存→解冻 细胞致死损伤一般发生在预冻和解冻两个环节上 避免细胞致死损伤是超低温保存技术研究的重点 该方法是将材料从0℃，或者其它预处理温度直接投入液氮。其降温速度在每分钟1000℃以上 高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎和块根，以及抗寒性较强的木本植物的枝条或芽，经过冬天的低温锻炼可以采用快速冷冻法 两步法 第一步：降温至转移温度。样品在添加冰冻保护剂后，用可控速率的降温设备（程序降温仪），以某个速率（0.1～0.5℃/min），将样品降温至转移温度（一般是-40℃～-70℃ ） 第二步：将处于转移温度下的样品投入液氮贮存 逐级冰冻法 将经保护剂处理的材料在0℃预处理后，依次通过不同温度的冰浴，如-10℃、-15℃、-23℃、-40℃等。一般每级约停留5min，然后浸入液氮 简成令等（1987）将甘蔗愈伤组织在0 ℃的冰冻保护剂（10％DMSO+0.5mol/L山梨醇）中预处理30－45分钟，接着用1 ℃/分钟的降温速度从0 ℃降到-40 ℃，停留1－3小时，投入液氮中保存，半年后仍可再生大量植株 玻璃化（Vitrification）是指液体转化为非晶体（玻璃态）的固化过程 根据物理学原理将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固，形成无规则的玻璃化固体，将玻璃化液和材料一起处理一段时间以后再投入液氮中，此时冰冻保护液和材料一起进入玻璃化状态。 玻璃化操作简单易行，适用于茎尖、合子胚等组织和器官；但玻璃化液对材料有一定毒害作用。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度 干燥法：利用无菌空气流、干燥硅胶饱和溶液的气相等对样品进行脱水，然后将样品快速投入液氮贮存(合子胚或胚轴) 预培养法：将保存材料在含有冰冻保护剂的培养基上预培养一段时间，以诱导脱水。然后将脱水材料浸入液氮中保存（合子胚和顶端分生组织） （a）诱导茎尖并让茎尖培养物在黑暗条件下低温（4℃）锻炼 （b）茎尖分离后用藻酸钙包埋 （c）将茎尖置于培养皿中，在超净工作台上干燥处理 （d）被包埋的茎尖在0.75mol/L的蔗糖培养基上预培养 （e）茎尖置于冷藏管中，浸入液氮进行超低温保存 （f）化冻处理 （g）植株再生 优点： 材料包埋后再进行预培养与干燥，增强了材料对干燥脱水和骤冷的抗性 使一些含液泡的外植体也可以进行液氮保存 材料的基本特性包括基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以