GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用荧光　RT-PCR　检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438. 1—2004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus 2004-02-14 发布 2004-02-15 实施 发布 GB/T 19438. 1—2004 言 GB/T 19438-2004((禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分： ——GB/T 1943 1—2004 《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》； ——GB/T 1943 2—2004 《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； ——GB/T 1943 3—2004 《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； ——GB/T 1943 4—2004 《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A 、附录C是规范性附录，附录B是资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人:赖平安、张鹤晓、谷强、王甲正、周琦、杨伟、赖少梅。 T GB/T 19438. 1—2004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测方法 1范围 本部分规定了禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。 2缩略语 下列缩略语适用于本部分。 2. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4 DEPC 焦碳酸乙二酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水 （配方见附录A ）。 2.6 Taq酶 Taq DNA聚合酶。 3原理 禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性 引物和一条特异性的荧光双标记探针 。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位 于引物结合区域内 。探针的5 ’端和3 ’端分别标记不同的荧光素 ，如5端标记FAM荧光素，它发出的荧 光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团 （用R表示），3 ’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内 能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号 ，称为淬灭荧光基团 （用Q表示）。 当PCR反应在退火阶段时,一对引物和一条探针同吋与目的基因片段结合 ，此吋探针上R基团发 出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的荧光信号 ；当PCR反应进行到延伸阶段时， Tag酶在引物的引导下 ，以四种核昔酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链 ；当链的延伸 进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Tag酶发挥它的5~3 ’外切核酸酶的功 能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，与此同吋标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再