质粒转化、细胞转染步骤.docVIP

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2019-07-09 发布于广东
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质粒转化、细胞转染步骤.doc

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转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。 1.质粒转染（transfection） 6-well-plate 每well 60-70%时transfection 接种时2.5×105个/ml/well 质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM 步骤：2.5ug质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基 opti-MEM 1.3ml，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell 把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀 37℃，CO2培养箱培养 2. 转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤： 50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合 ↓ 冰浴30min ↓ 42℃热激90s ↓ 迅速冰浴2min ↓ 向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态 ↓ 涂板正培1h后，倒培过夜