生物技术制药试验-安徽生物药物研发技术服务平台.PPT

李浩 博士 Tel: 0551Email: lihao16@ustc.edu.cn * 安徽省重组蛋白质药物工程技术研究中心 实验内容与要求 2018-05-04 《生物技术制药实验》 FERMENTATION Process Control 上游工程 UPSTREAM PROCESSES 下游工程 DOWNSTREAM PROCESSES 生产菌种 发酵工艺和发酵设备 产品的提取 * 决定发酵工业生产水平的三要素： 生产菌种 发酵工艺 发酵设备 药品 食品 能源 现代发酵工业发酵定义: 利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制造微生物菌体本身,或其直接代谢产物及次级代谢产物的过程. 发酵概念 巴斯德认为: 发酵是酵母在无氧状态下的呼吸过程,是生物获得能量的一种形式. C6H12O6+2ADP+2H3PO4→ 2CH3CHOH+2CO2+2ATP（？） 发酵工程的特点： 反应条件温和:常温常压 原料来源广泛一般无需精制 众多反应都在同一发酵罐内完成 发酵的特点 微生物的特点： 体积小,比表面积面积大 吸收多,转化快 生长旺,繁殖快 适应强, 分布广,种类多易变异 发酵的特点 发酵的基本条件 要有某种合适的微生物或其它生物细胞 保证微生物能够进行代谢的各种条件(培养基,温度,溶解氧) 微生物发酵的场所 目的产物的提取和精制 发酵工艺组成部分 培养基制备 ↓ 种子培养→发酵罐→产物的提取精制 ↑ 无菌空气 菌种 ↓ 发酵菌种 进行发酵生产的菌种必须是经过选育的具有优良生产性状的菌株或是经过基因工程改造的“工程菌” 在发酵生产中，要对生产菌种不断地进行选育和菌种的复壮工作，以防止其优良性状的丧失。不断提高生产菌株的生产性能。 生产菌种的衰退，与菌种的传代次、保藏方法和培养条件等密切相关 发酵定义：微生物发酵即是指利用微生物（重组毕赤酵母），在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为所需要的产物（蛋白质）的过程。 主要使用的仪器设备： 发酵罐 灭菌锅/柜 空压机 冷水机 离心机 切向流系统 主要培养基：MGY BSM BMGY 主要检测数据：pH 、 Temp 、DO 、 Feed（pump） 微生物生长条件 碳源种类：葡萄糖、甘油、甲醇、山梨醇 氮源种类：酵母膏、蛋白胨、氨水、硫酸铵 生长因子：维生素 微量元素：铁、锰、锌、铜、钼、硼等。 pH：3-7之间，生长阶段和产物阶段可能不同 Temp：生物热与搅拌热，两个阶段的最适温度可能不同 DO ：空气流量、纯氧流量、搅拌转速 适宜的生长条件 培养基 一级种子液 二级种子液 发酵罐培养 活化的毕赤酵 母工程菌种 后期纯化 我们的研究阶段 候选药物研究阶段和临床前研究阶段 治疗性重组蛋白的临床前研究 候选药物研究阶段 临床前研究阶段 演示实验所在阶段 实验内容及安排 bioFlo/CelliGen 115 硬件：主机、罐体、底座、顶盖、电机、电极线、电极、管路等。 软件：主机操作（具体参数设置） 电脑软件操作（数据监测收集） 发酵过程 Non-Reduced(25ul) Hr: M 24 36 42 50 58 65 65 69 Reduced(25ul) SDSNative PAGE 8% 纯化后所得样品 发酵注意事项 设备篇： 清洗发酵罐时将挡板拿出清洗未放回/挡板未卡住 未及时更换DO电极缓冲液 补料管道阻塞导致补料不顺☆☆☆ 消泡剂准备不充分，导致泡沫过多冒罐☆☆☆ DO、pH标定不准确，发酵过程中出现漂移 冷井长时间使用出现短路跳闸情况，应及时更换备用保险丝。 发酵罐灭菌时未夹紧管道，导致培养基流失☆（如果是隔天取出需要将门排空防止第二天负压） DO电极膜发生机械性破损，未及时更换 发酵用试剂未及时续订，延误工作进度☆ 操作篇： 发酵前期产热较低，冷井温度可设置为发酵温度，后期代谢加强产热升高时应提前对冷井降温，避免温度过高（致死温度：毕赤酵母32℃，大肠杆菌60℃10min）☆☆☆☆ 发酵前未镜检，种子液染菌未及时发现☆☆☆☆ ０.２２ｕｍ空气滤头破损未及时更换 未打开ＤＯ与Ａｇｉｔ偶联，导致发酵后期ＤＯ偏低。☆☆ 未将ＤＯ、ｐＨ、ｐｕｍｐ等设置为ａｕｔｏ☆ 补料瓶流干时未及时补加☆ 氧气用完未及时更换☆☆☆ 出现DO spike 未及时补料，充分考虑种子液特性，接种量，尤其是OD值，提前准备好补料瓶。☆ 500-1000rpm 10LPM 1000rpm 15LPM 21ml/L/H 1000rpm 15LPM+氧气 2~4~6~8~10~12ml/L/H 氧气调节不当 网址：gmp.ustc.edu.cn