实验专题模块五 RNA的提取及定量PCR检测技术.pptVIP

图3-9 TaqMan荧光探针 实验专题模块五 RNA的提取及定量PCR检测技术 总RNA的提取 反转录 实时荧光定量PCR RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。 获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如cDNA合成、定量PCR、Northern杂交及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。 RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响后续RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度相对较大。在实验中，一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶；另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。 注意与要求： ① RNA操作应在专门的区域进行，离心机、移液枪、试剂等均应专用。 ② 操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。 ③ 实验使用枪头、离心管等塑料制品需均经由0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡过夜，然后灭菌，烘干。所有玻璃制品都必须在180℃烘烤2小时。尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。 ④ 配制溶液用的酒精，异丙醇等应使用RNA实验专用的试剂。 提取获得的组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物，即可以利用逆转录酶进一步反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测目的基因的表达。 鉴于基因表达差异分析在临床实践中的广泛应用，本模块主要以食管癌细胞中目标基因如LCN2 (lipocalin 2) 转录表达水平的定量检测为例，旨在使学生能够系统地理解RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR检测过程，熟练使用有关仪器和软件，掌握基本操作和分析过程，并学会运用相关的实验技术与方法，利用网上的分子生物学信息资源，独立设计出相关解决方案，并能够评价与实施这一方案。 实验一 总RNA的提取 一、实验目的 1. 了解并掌握总RNA提取的基本原理。 2. 熟悉TRIzol法提取细胞总RNA的具体操作过程。 二、实验原理 总RNA的提取围绕着一条主线，即保护RNA的完整性，使RNA免受RNase的酶解。围绕这条主线，要关注RNase-Free工作环境的建立、反应中RNase-Free条件的保持、RNA的保存等一系列细节问题。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即1）样品细胞或组织的有效破碎；2）有效地使核蛋白复合体变性；3）对内源RNA酶的有效抑制；4）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 TRIzol试剂提取总RNA 该法是(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改进方法，其产率与(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相当。它是以(异)硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚而得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。 三、 实验操作 1. 样品处理： a 单层培养细胞：细胞接种在12孔培养板中，待细胞满度达90%以上或成融合状态时，弃去培养基，用1ml枪头将剩余培养基吸干，每个孔直接加入500μl的TRIzol试剂裂解细胞（每10cm2面积加1ml试剂）．将培养板放在三维迷你摇床上，室温（15-30℃）下充分裂解，至少需5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。将裂解液转移至1.5ml离心管中。（注：加TRIzol之前勿需洗涤细胞。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不