微生物分离技术.doc

微生物分離技術 目的:1.學習如何在固體培養基上純化微生物並得到單一菌落 2.學會劃碟法、塗碟法、倒碟法的操作技術 原理:微生物經由增殖步驟可將想研究的菌種在選擇性培養基中 大量繁殖,然而可能仍有少數其他菌種從在其中,無法完成 純化,因此有必要進一步利用分離技術,將微生物分離成獨 獨立菌落,達成純種培養? 設備:錐形瓶、玻璃培養皿、接種環、三角彎棒、吸球、定量玻 璃管、取藥杓、酒精燈、螺紋試管、試管蓋、秤藥紙、試 管架、恆溫培養箱 操作過程: 劃碟法 把水樣做10倍稀釋 為了要滅菌所以用酒精燈燒接種環(要等冷卻才可塗抹菌液) 用45度角劃在培養基上，分別在四個不同的地方，但不要重複劃在同個位置 隔天看結果 塗碟法 取原液1ML加入9ML的培養水中稀釋到你要的，使用定量吸管吸取連續3個濃度試管當中的0.1ML，分別滴入1~2滴的菌液在培養皿中。 將酒精中過火滅菌過的三腳彎棒，等冷卻後進行塗抹法，利用旋轉方式均勻的塗在培養皿的四周。 放入恆溫培養箱中，等隔天後再來看結果. 倒碟法 1.先連續稀釋水樣 2.再從滅菌釜中拿出的NA培養基，要趁還未完全變冷時，用 無菌玻璃定量吸管吸取其他稀釋管之菌液一滴分別加入無菌培養皿中央。 3.倒入15~20ML的NA培養基在培養皿中，混合均勻後冷卻凝結。 4.放入恆溫培養箱去培養，隔天觀察紀錄。 實驗結果: 劃碟法(原液下去做的): 菌落數:297個 198個 菌落數:8個 70個 菌落數: 120個 倒碟法: 菌落數:10的負六-150、65個, 10的負七-180、36個 菌落數: 10的負八-無法計算、31個 原水樣菌落數取: 取10-8稀釋次數 (150+65)/2/0.1/10-8 =107.5 * 10+9 原水樣菌落數取: 取10-7稀釋次數 (180+36)/2/0.1/10-8 =108 * 10+9 塗碟法: 菌落數:10-8有無法計算,206個 10-7有 81,250個 菌落數:10-6 225和186個 原水樣菌落數取: 取10-7稀釋次數 (81+250)/2/0.1/10-7 =165.5 * 10+8 原水樣菌落數取: 取10-6稀釋次數 (225+186)/2/0.1/10-6 205.5 * 10+7 問題與討論: 用這三種分離技術法所得到的實驗結果是否成功分離維生物，即在培養基上形成單一菌落?若沒有單一菌落，請說明失敗原因。 有成功但有些則是聚在一起，只是並不明顯。有些較多，有些較少，有些則看不太出來。 試述劃碟、塗碟、倒碟法的實驗原理、步驟與實驗中應該要注意 哪些事項? (1)原理-主要是藉使菌數越來越少，最後達到單獨分離之目的。 (2)步驟- a.倒碟-用接種環連續稀釋，各取1ml的稀釋菌液和固體培養基一起放入以滅菌的培養皿，均勻混合後等待凝固放在培養箱培養，即可得到分離的菌體。 b.劃碟-用接種環均勻劃在固體培養基的表面，即可將混合生長的菌落分離成單一菌落。 c.塗碟-在培養皿上滴入一些的菌液，利用三角彎棒均勻的塗抹菌液，讓菌液均勻分布在固體培養基表面，即可完成。 (3)注意事項- a.劃碟時接種環要傾斜45度角為了避免劃破培養基。 b.在劃碟的時候第一區之菌液不可和第二區之菌液末端交接，其餘第三、第四也是如此。 c.塗抹時，一定要用三角彎棒均勻的塗抹四周才行。 d.拿取從滅菌釜中製備的NA培養基時，稍微的降溫到45度左右就要趕快倒入培養皿中以免先變成固態。 e.培養基在培養皿加蓋前，由於容易受到空氣中微生物的影響，因此製作時蹈入的體積為1/3~1/2，這樣可減少和空氣接觸的機會，避免受到污染。 為何實驗要有對照組，其目的為何?若對照組上有長微生物又代表什麼? (1)用來判斷實驗操作過程的準確度，例如操作時是否一直保持無菌狀態。 (2)那可能是不小心有打開它，造成空氣中的微生物跑進培養皿中，因此才會有這樣的情形產生。 討論: 1.倒碟法10-6和10-7的原菌落差不多是為何? 因為我們10-6裡有出現一大片因技巧不好而導致的錯誤,所以把那一大片看成一個菌落。 2.倒碟法、塗碟法、劃碟法實驗結果是否合乎理想狀態? 倒碟，菌落數有遞減，有成功。 塗碟，還是有一些菌落沒有分離開，聚在一起，有點小失敗。 劃碟，因為是第一次劃，所以有些手忙腳亂，但有些還可以。 3.為什麼塗碟會聚在一起沒有分離開來?我們討論的結果是可能是稀釋的還是不夠多，因為汙水的菌落數量非常的濃厚，所以歸類在沒有稀