cDNA文库的构建和筛选.pptVIP

第五章 cDNA文库的构建和筛选 将RNA转变成cDNA以及cDNA文库构建 cDNA文库筛选策略 cDNA表达文库的功能筛选 用cDNA检测基因的表达 体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因 第一节：将mRNA转变成cDNA cDNA：与mRNA互补的DNA，称为cDNA。 由某个生物体的某个器官或组织mRNA反转录形成的总cDNA，构建形成的基因文库，称之为cDNA文库 第一节：将mRNA转变成cDNA 一、mRNA的分离纯化 RNA在体内具有容易被内切核酸酶（RNase）降解以及自然降解的特性。分离以及保存RNA需针对上述特点进行。 加入RNase抑制剂 Ribonucleases (RNases) ? RNases are naturally occurring enzymes that degrade RNA ? Common laboratory contaminant (from bacterial and human sources) ? Also released from cellular compartments during isolation of RNA from biological samples ? Can be difficult to inactivate 第一节：将mRNA转变成cDNA 二、cDNA 的合成 A、用polyT作为引物 第一节：将mRNA转变成cDNA 在构建cDNA 文库之前，需要将单链cDNA合成双链，主要有以下二种种方法： A、降解mRNA-cDNA杂合链中的RNA，cDNA第一链3’端回折充当引物，形成第二链 第一节：将mRNA转变成cDNA B、用来自E. coli中的RNase H 降解的RNA充当引物，在DNA聚合酶和连接酶的作用下合成第二链DNA cDNA 文库的特点 cDNA 文库代表了某个器官或组织中的RNA群体。 在某个给定的cDNA文库中某些表达丰富的mRNAs 的克隆数目比较多，在文库中也有少数的克隆代表稀少mRNAs 如果某个基因有多种拼接方式，在文库中也有代表该基因不同拼接方式的克隆。 第一节：将mRNA转变成cDNA 三、cDNA克隆载体 1、根据不同的筛选策略选择 不同的载体 质粒载体：用功能测定的方法进行筛选 噬菌体载体：分子杂交或抗体筛选。 2、噬菌粒载体：是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。　 三、cDNA克隆载体 它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。。 优点：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。 第二节 cDNA文库的筛选 基因序列未知 常用筛选cDNA文库的方法 A、用已知氨基酸序列来获得简并序列 B、纯化蛋白质相应的抗体 C、利用同源基因（?）中的目标基因序列 D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针 某些基因编码的蛋白质的性质已知 通过氨基酸序列反推核苷酸序列 TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG 进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆 B、利用抗体进行杂交 免疫学筛查：检测克隆基因编码的蛋白 免疫学筛查所需要的抗体 免疫学筛查首先获得抗原 C、利用同源基因中的目标基因序列 用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针 差示杂交P112 D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针 扣除杂交P112 第三节 cDNA表达文库的筛选 研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用 酵母双杂交技术 噬菌体展示技术 第三节 cDNA表达文库的筛选 1、噬菌体展示技术原理 A、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白