罗非鱼hepcidin1-5成熟肽在毕赤酵母中的表达和活性分析.pdfVIP

万方数据 摘 要 Hepcidin 是一类重要抗菌肽，具有抗菌谱广和作用机制独特等特点。罗非鱼是我 国重要的出口品种，但近年深受细菌性疾病困扰。在水生病原菌的耐药性日渐严重的 背景下，研究罗非鱼hepcidin 的重组表达可为新型抗菌药物的开发提供借鉴。本研究 拟通过毕赤酵母GS115 （Pichia pastoris GS115 ）分泌表达TH1-5，并对表达产物的抗 菌活性和免疫调节功能进行了初步研究。具体内容和结果如下： （1）TH1-5 成熟肽在毕赤酵母中的表达 人工合成经毕赤酵母GS115 密码子偏好性优化（两端添加EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切 位点）的TH1-5 cDNA ，克隆到PUC57-simple 载体上，经双酶切后克隆到pPIC9k 载 体，构建pPIC9k-TH1-5 表达载体。pPIC9K-TH1-5 经PCR 和测序验证正确后，分别 用BglII 或SacI 酶切线性化，电击法转入Pichia pastoris GS115 ，筛选出的阳性克隆 （YH3 ）经甲醇诱导表达，诱导上清冷冻干燥后-80℃保存。 （2 ）Dot-ELISA 检测TH1-5 方法的建立 TH1-5 合成肽为标准品（阳性对照）、自制兔抗TH1-5 抗体为一抗、HRP-羊抗兔 IgG 为二抗，建立检测TH1-5 的Dot-ELISA 法，其中一抗最佳稀释度为 1:50，二抗 最佳稀释度为1:200。通过建立的Dot-ELISA 法检测到YH3 的表达上清中含有TH1-5 。 （3 ）重组表达TH1-5 对病原菌和鸡外周血淋巴细胞的影响 含重组表达 TH1-5 的 YH3 表达上清（简称 TH1-5 上清）对大肠杆菌 （CMCC44102 ）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923 ）、绿脓假单胞菌（ATCC27853) 、粪 肠球菌（ATCC29212 ）具有明显的抑菌活性。 TH1-5 上清单独作用于鸡外周血淋巴细胞，可促进淋巴细胞的增殖，但与对应浓 度的空载体（P0 ）表达上清比较差异不明显。0.2～1.6 mg/mL 的TH1-5 上清与0.125 μg/mL 的ConA 共刺激鸡外周血淋巴细胞，显示出比相应浓度空载体(P0)表达上清更 强的协同促进增殖效应。 本研究成功构建了pPIC9k-TH1-5 表达载体，获得分泌表达TH1-5 的毕赤酵母工 程菌，并建立了检测重组TH1-5 的Dot-ELISA 法。重组表达的TH1-5 具有抗菌活性 和协同ConA 促进鸡外周血淋巴细胞增殖的作用。 关键词：罗非鱼hepcidin ，酵母分泌表达，Dot-ELISA ，抑菌活性，淋巴细胞增殖 I 万方数据 Abstract Hepcidin is an important class of antimicrobial peptides with broad antimicrobial spectrum and unique mechanism of action. In recent years, tilapia is important species for export in china, but it was suffered from serious bacterial infection. Under the condition of increasing trend of aquatic pathogens drug resistant, the research of recombinant expression of tilapia hepcidin, can