三琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA.PPT

粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 * 三峡大学李晓玲编写与制作 * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoR V 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 　 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 平头末端： 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示。斜体 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，正体。即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，正体。如Hind Ⅰ, Hind Ⅱ，Hind Ⅲ等。 2. 限制性核酸内切酶的命名法 一、DNA的限制性酶切实验原理 实验材料和设备 λDNA、PUC19质粒DNA、自提质粒DNA等 限制性内切酶 0.2ml的PCR管、移液器和枪头等。 恒温水浴锅或恒温培养箱 凝胶成像电泳系统 * * 二、操作步骤 1、质粒DNA的限制性酶切反应 　（1）将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA ≤1ug， 10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl，ddH2O X μl至总反应体积20 μl，用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。　 （2）混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）， 37℃保温1小时，使酶切反应完全。 （3）每管加入2μl 0.1mol/L 的EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。 （直接电泳分析可省略） (4) 将酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。 * * 【实验步骤】 1.取4μl的λDNA溶液，加2μl酶切缓冲液，EcoRⅠ酶1μl（2U),无菌水补至总体积20μl，37℃保温1小时，加凝胶上样缓冲液（6×）2μl，准备电泳。 酶切溶液： EcoRⅠ酶切位点 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-3’ λDNA Buffer EcoRⅠ ddH2O Total 4μl 2μl 1μl 13μl 20μl Lambda DNA的EcoR Ⅰ酶切位点 * * 产生片段长度 21226bp 7420bp 5803bp 5642bp 4877bp 3529bp １．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1U指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对应２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。 三、注意事项 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。 ２．ＤＮＡ： 三、注意事项 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。 ３．反应缓冲液： 三、注意事项 大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ，Hind