荧光检测中波长优化的方法.PPTVIP

光谱扫描的重要性 演示：一个红色荧光染料的检测波长优化 微孔板的波长优化 一 固定发射波长Em，扫描激发光波长Ex 设定Em为高于预期波长 (700 nm). 设定Ex 的扫描，为了避免灯光的干扰，到离设定的Em 10nm处就停止 (600 – 690nm). 设置缓冲液空白对照 激发波长扫描 微孔板发射波长扫描 微孔板波长优化：最终方案 Ex/Em 最大峰 -- 650/665nm (小Stokes 偏移) 必须用cutoff滤光片遮住入射灯光 Cutoff滤光片的波长在 Ex 和 Em 波长之间 Cutoff滤光片可以降低本底信号并能让发射光透过 Cutoff滤光片可选择的范围区域630, 665 695nm. 665 nm 滤光片最为合理因为它可以遮蔽入射灯光 必须增加 Ex/Em之间的分离把荧光从入射灯光中区分开来. 降低 Ex 波长和增加 Em 波长 降低 Ex 波长到最大峰的 ~90% (645 nm) 并用665nm的cutoff滤光片，扫描Em波长. 出现最大的信号和最小的背景信号。 微孔板波长优化：最终扫描 * * Stokes’ 偏移 Stokes偏移越大, 越容易测量 Ex/Em大约在~650nm附近，微小的Stokes偏移 Blank Sample 激发峰 ~ 650 nm 灯光干扰 二 固定激发波长Ex，扫描发射光