杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆与功能分析.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 smallsubunitsofnbulose RbcS(the 1,5-bisphosphate 编码l，5．二磷酸核酮糖羧化／加氧酶限ubisco)小亚基的基因。这种酶是叶绿体内含量最 高的一种蛋白，位于叶绿体基质内，能催化光合作用中固定C02的反应，其小亚基RbeS 对全酶Rubiseo的结构和功能起调控作用，且常以基因家族的形式定位于一条或多条染 色体上，大多数高等植物中包含4-10个RbcS基因【l】，各基因表达的氨基酸序列有差异， 但是蛋白质在功能上基本是相似的。高等植物中的RbcS基因家族各成员在植物的各个 器官及发育的各个时期的表达情况不完全一样【2—3】，所受的调控机制也不同，这种表达 调控上的不同在转录水平和转录后水平都存在，各个基因在DNA．蛋白质结合和mRNA 稳定性方面都存在差异，也就是说以基因家族的形式存在不是单纯地为了增加基因产物 的表达【41。 盐分是影响植物发育增殖的一个重要因素，高盐下，在多数植物以及蓝藻中，盐胁 迫是抑制光合作用的，但盐藻却能增强光合作用，Liska等【删的研究表明当盐藻从低盐 环境转移到高盐环境时，它能通过增强光合作用，增加C02的同化，从而产生大量甘 油，达到适应高盐环境的目的。其中RbcS在C02的同化及淀粉合成方面发挥重要作 用，但是盐藻的RbcS在盐分胁迫下的表达调控机制研究不多。 本研究根据RbcS高度保守的氨基酸序列设计简并引物，采用RACE法扩增其5’和3’ 上下游未知序列，得到RbcS2新序列。再根据全长eDNA设计特异引物，利用荧光定量 PCR方法分析光照和盐分对其表达的影响，这些为下一步研究RbcS基因家族中各成员 的结构和功能，以及为探索盐胁迫下盐藻耐盐的分子机制提供实验依据。 实验方法 1 简并引物扩增杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的部分eDNA序列 根据GenBank上登录的杜氏盐藻、莱茵衣藻、红球藻、团藻等藻类的Rbcs基因高 度保守的氨基酸序列设计简并引物。采用TRIzol试剂提取杜氏盐藻细胞总RNA，用 种的RbcS基因比对分析。 2 RACE扩增杜氏盐藻RbcS2上下游序列 下游未知序列，PCR产物用T-A法亚克隆到pMDl8-T载体上，酶切鉴定后测序 T 中文摘要 3杜氏盐藻RbcS2全长cDNA的拼接和分析 将扩增出的简并cDNA,5’和3’RACEcDNA进行拼接，到eDNA全长序列，并利用 DNAMEN和GcnBank BLAST分析核苷酸和氨基酸的同源性及密码子偏好性。 4杜氏盐藻RbcS2功能分析 根据已克隆到的杜氏盐藻RbcS2的cDNA设计特异引物，以已知的杜氏盐藻保守基 总RNA，反转录成cDNA，利用荧光定量PCR分析其光照和耐盐功能。 实验结果 l 简并引物扩增杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的部分cDNA序列 测序结果表明，简并引物扩增得到的部分cDNA片段长为209 bp，其氨基酸序列为 新片段。· 2 RACE扩增杜氏盐藻RbcS2上下游序列 5’RACE得到一个有302个核苷酸的序列，除去部分已知序列及非编码区序列，共 得到一个有168未知核苷酸的序列，由其推导的氨基酸序列有56个氨基酸残基，5UTR 非编码区序列，共得到一个有271未知核苷酸的序列，由其推导的氨基酸序列有90个 氨基酸残基，3UTR部分有218个核苷酸。 3杜氏盐藻RbcS2全长cDNA的拼接和分析 全长为869 bp，包含561bp的开放读码框，推导成多肽链包含187个氨基酸，BLAST 结果显示，RbcS2的氨基酸序列与其他物种的Rbcs的氨基酸序列有很高的同源性，且 列，且与其它微藻的氨基酸序列同源性高些，与高等植物的氨基酸序列同源性低。对该 基因密码子的使用偏好性进行分析，具有两种以上同义密码子的氨基酸偏好使用以C／G 为结尾的密码子，表明杜氏盐藻和其他真核生物一样一般偏爱以C／G结尾的密码子。 4杜氏盐藻RbcS2功能分析 在黑暗条件下，RbcS2的