流式细胞术应用技巧.pptVIP

散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 FL5 - PC7 抗原分布:Important for method optimization 表面，胞浆，核内 是共同检测还是分别检测？ Intracellular Cytokine-Protocol 白血病全过程评价 CIK细胞治疗过程的评价 肿瘤细胞免疫特点 AIDS全过程免疫细胞评价 骨髓移植或CD34细胞移植 1. 白血病分型 形态学、免疫组化、PCR 2. 细胞因子 生物活性测定法、RIA和ELISA法、DNA分析法 外周血单个核细胞产生细胞因子检测法——FCM、 ELI-SPOT、FCM（STAT） 3. HLA B27/B7 FCM、免疫法 4. 凋亡、蛋白表达 FCM、免疫组化、PCR 5 . CIK、DC、CD34、CD44V、CD31等 多种细胞因子FCM（STAT）的原理 Color-coded Microspheres Differentiation of 10 Populations* HLA-B27 检测中的问题 利用B27 荧光强度判定的阳性率很低。 原因： 通常B27的判定标准是荧光强度大于8 ，但这个标准是在加全量抗体的条件下做的，而目前大多数用户只加半量或1/4量做，导致荧光强度降低。 解决方法： 1 加全量抗体。 2 判定标准改为用阳性率大于90%。 ANNEXIN V/PI检测凋亡的问题 结果偏低 原因：1 没有用试剂配套的连接缓冲液。 2 消化贴壁细胞时用胰酶。 解决方法：1 消化细胞时不要用胰酶，要用EDTA，用配套的缓冲液。 PNH检测的问题 粒细胞上CD55，CD59检测结果偏低，而在红细胞上正常。 原因：在进行抗体染色之前，没有进行溶血，导致了抗体先和红细胞结合，而无法与白细胞充分反应，产生了阴性结果。 解决方法：在染色之前，先进行溶血洗涤，然后再染色。 DNA检测 1、固定问题：70%酒精 106 细胞 700 ul 冰乙醇 2-3min 300 ul 蒸馏水 4-72 hr 2、离心：1500转 3、透膜： triton x -100 （intra 1、intra 2） 细胞因子的检测 1、解决干扰碎片 （1）、-20℃静置，＞24hr （2）、4500转，离心 2、强度问题：外延浓度 0、5、10、20 Capture Beads Lysate Sample Detector Antibodies Wash Analyze on flow cytometer FL4 Main Menu *Human Th1/Th2 Cytokine I Kit FL2 (Reporter Parameter) FL4(Differentiator Parameter) Main Menu 结果偏高 原因：非特异性结合多 解决方法：换用新的试剂。 1、质粒转染中： 转染率 疫苗 转染的强度 2、同时分析转染率和转染强度 3、稀有细胞的额外发现： T亚期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK细胞：CD3-CD16+56+ CD3+CD16+56+ 4、Tunecl方法中 不同周期的凋亡状况 细胞阻滞状况 DNA断片发生时SOS状况 五、流式细胞仪的应用技巧四 了解相关知识及现有的评价方法，充分应用流式细胞 荧光显微镜下经丫啶橙/溴化乙啶染色 SGC-7901细胞24h SGC-7901蒿甲醚组24 h SGC-7901 DDP组24h ECV-304细胞 24h ECV-304蒿甲醚组24h ECV-304 DDP组24 h 六、流式细胞仪的应用技巧五 专项应用中的问题及解决方案 免疫细胞相对绝对计数 造血干细胞和其他稀有细胞的检测 血小板活化、膜糖蛋白及抗体检测 DNA倍体分析，周期、异倍体分析 细胞内因子（Th1/Th2） 细胞因子（体液及培养液因子） 各种凋亡检测（Apo.2.7 Tunecl、DNA亚二倍体） 组织中免疫细胞和其他细胞（如CXCR、