第十六章__分子流行病学.ppt

图2 T-A克隆后酶切鉴定结果  Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of JR23 strain  3.平-粘连接法 此法在目的DNA和载体DNA只有一个匹配 酶切位点，又要考虑目的DNA插入方向时使用， 也属于定向克隆。此法优点是单方向插入，非 重组体克隆背景低。 上述各种方法建立的重组质粒DNA是否成 功需要鉴定。 常用方法有： ①互补； ②插入失活； ③菌落原位杂交； ④限制性内切酶分析； ⑤DNA序列分析。 实验中可根据具体情况来选择鉴定方法。 （五）DNA的凝胶电泳(Gel electrophoresis of DNA) 电泳技术是分子生物学领域中常用的实验技术。 常用琼脂糖凝胶电泳和PAGE或SDS分离、 鉴定、纯化DNA或RNA。 此法具有简便、快速、分辨率高等优点，并可 将分离片段（电泳带）从凝胶中回收用于 DNA 重 组或克隆。 1.琼脂糖凝胶电泳 (Agarose gel electrophoresis) 琼脂糖加热至90℃-100℃即可熔化成透明液 体，浇到电泳槽内，冷却后即可形成凝胶，用于 电泳，常用TAE作为电泳缓冲液。 电泳时根据DNA片段大小确定凝胶浓度，一 般用0.8-1.0%。一般检测鉴定时，用常规琼脂糖 凝胶电泳，要想从凝胶中回收DNA，需要低熔点 琼脂糖凝胶电泳，若要分析单链DNA，需要碱性 琼脂糖凝胶电泳。 图 3 pBSK+-NDV HN DNA琼脂糖凝胶电泳 1：Marker；2,3,5,6,9,10,12：突变株；4,7,8,11：野毒株 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE PAGE分两种： ①非变性PAGE：非变性PAGE用于分离纯 化双链DNA片段，缺点是不能测定DNA的大小， 因为迁移率受碱基组成和序列的影响，同样大 小的DNA片段由于空间结构不同，其迁移率出 现差异。 ②变性PAGE：变性PAGE用于分离和纯化 单链DNA片段，DNA的迁移率与碱基组成和序 列有关，可用于DNA序列分析，分离同位素标 记的探针等。 1 2 3 4 5 ? 图 4 风疹病毒E1基因表达产物SDS（上清，考马斯亮蓝染色） 1: Negative control GS115 2: Plasmid control pGAPZαA 3: Low range protein marker 4: Expression strain 1 5: Expression strain 2 3.从凝胶中回收和纯化DNA (Recovery from gel and purificaiton of DNA) 在进行基因克隆、重组、探针标记等实验 中，需要从凝胶中回收DNA，回收的方法有： 低熔点琼脂糖法 压碎浸泡法 透析袋洗脱法 DEAE-纤维素膜法等。 上述每种方法均有各自的使用范围、回收 率和特点，应根据情况选择合适的回收方法。 （六）核酸杂交(Nucleic acid hybridization) 据DNA碱基互补配对原理，先制备一条带有 标记的多核苷酸链作为探针,检测标本中与之相对 应的那条互补链，称为核酸杂交 ( nucleic acid hybridization)。 核酸杂交技术具有高度特异性，广泛用于对 待测DNA或RNA进行定性和半定量分析。 核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、 cRNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等。实验 时根据研究目的选择不同类型的探针。探针需用 标记物标记。 标记物一般分为