基因克隆以及表达载体.ppt

但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，非接合型质粒也可以被转移。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。 replicate independently single sites for a large number of restriction endonucleases selectable marker low molecular weight, multiple copies ; 缺少mob基因 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 replicate independently single sites for a large number of restriction endonucleases selectable marker low molecular weight, multiple copies ; 缺少mob基因 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 λ噬菌体载体的类型 ①置换型: 思考题 名词解释：载体、质粒的不相容性、柯斯载体、人工染色体载体、基因打靶、RNAi 什么是克隆载体，克隆载体必需满足哪些基本条件？ 表达载体需要的基本元件及其作用？ 简述RNAi的作用机制。 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子 ） 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 果在起始密码子上游发现核糖体结合位点，就可以更肯定的说找到了一个ORF 植物根癌土壤杆菌（Agrobactertium tumef-aciens）菌株中存在的质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来表达信息，使植物细胞肿瘤化。即此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因，这是很独特的。其与植物DNA结合的部分（称为 T－DNA） 。在T－DNA以外的区域，存在着对质粒的传递性、opine的透过和分解等（在细菌中表达的性状）的基因 ①Ti质粒的来源 　　大多数以植物作为宿主有机体的克隆载体都以Ti质粒为基础，Ti产生于一种称为根癌农杆菌的土壤细菌。 ②Ti质粒的特点　　 根癌农杆菌侵入植物组织后，可导致冠瘿的癌性生长。在根癌农杆菌的感染过程中，Ti内称为T-DNA的部分整合到植物染色体DNA中。 ③Ti质粒的应用 　　以Ti质粒为基础的克隆载体，利用T-DNA的整合能力，携带有用基因进入植物基因组中，这些基因可使植物具有抗病等有利特征。 报告基因：其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。可见报告基因实质是起到了判断目的基因是否已经成功的导入到受体细胞并且表达的标记基因的作用。 RNA干扰(RNA??interference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double??stranded??RNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional??gene??silencing，PTGS)。外源dsRNA??进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small??interfering??RNA,??siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced??silencing??complex，RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi具有特异性和高效性。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。 shRNA：小发卡或短发卡RNA（a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA）是一段具有紧密发卡环（tight hairpin turn）的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。 利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6 启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成 siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上（RNA-induced silencing complex