FuGENE 转染流程.docVIP

FuGENE HD真核细胞转染流程 细胞和质粒的准备 将约5-10×105 A549细胞接种于6孔细胞板中，用含10%小牛血清的F-12k培养过夜，约60%~80%铺满时用于转染。 注：一般荧光试验细胞稀一点为宜；WB试验细胞密一点为宜 转染时所用质粒均用转染专用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后测定其浓度和纯度，浓度在0.1μg/μL以上且纯度在1.8±0.5 (OD260/OD280)的质粒用于转染，质粒提取的具体步骤按说明书提供的方法进行。（注：质粒浓度测定未必可行，需同时进行酶切和PCR鉴定方可。） 按照转染剂量，计算质粒使用浓度 转染流程 注：由于不同转染试剂对质粒大小、性质、转染量、细胞的种类有很强的特异性，必须谨慎选择转染试剂。以多次转染成功使用的转染试剂为佳。 将培养板中的上清弃去，用细胞用无抗无血清F12K洗涤三次后，每孔加入800ul 无抗无血清F12K。 取出FuGENE HD转染试剂，使其温度上升到室温。 计算好质粒、转染试剂、以及无抗无血清F12K的量，最终液体总量为100 ul。 准备好无菌指形管，按计算结果加入90-98ul的无抗无血清F12K，加入2ug 质粒，振荡器混匀；随后加入6ul FuGENE HD转染试剂，立即震荡混匀（转染试剂加入时不能沾到管壁上！） 室温静置7-12分钟后，将质粒：转染试剂混合液均匀滴加在细胞平板孔中，吹打混匀或者震荡混匀。放入37℃培养箱孵育。 转染后2 h后加入含有血清的F12K，使血清终浓度达到1-4%，上清总量达到1.5-2 ml。细胞平板放入37℃培养箱培养24-48h。 转染后特定时间点，用4℃预冷的PBS漂洗细胞3次，加入含有PMSF的Western细胞裂解液冰上裂解15min。随后刮取细胞转移至1.5ml EP管中，12,000rpm离心10min，取上清加入5×SDS上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中煮沸10min。剩余样品冻存-20℃ 冰箱备用。