血管紧张素Ⅱ对hERG钾通道的慢性调节机制分析.pdfVIP

中文摘要 血管紧张素II对hERG钾通道的慢性调节机制研究 摘 要 心肌肥厚、心力衰竭是冠心病、心瓣膜病、高血压等多种心血管病的 常见合并症。心肌肥厚、心力衰竭时发生的病理性电重构使心脏的电不稳 定性增加，常伴发各种心律失常。心衰病人在泵功能稳定的情况下半数以 C2urdiac 上因发生恶性心律失常而猝死(即心源性猝死Sudden Death， SCD)。因此，阐明病理情况下心律失常产生机制，寻找药物作用靶点具 有重要意义。 已知心肌肥厚、心力衰竭病理发展过程中全身和局部的肾素．血管紧 张素系统(renin．an百otensin 要的原因，该系统的关键成分血管紧张素II 受体从而激活多种细胞内信号通路，对心血管功能发挥广泛的调节作用。 实验证明，过表达人AngII基因的大鼠常因严重室性心动过速而猝死；在 急性分离的犬和大鼠的心室肌细胞、以及转染编码k通道基因Kv4．3哺乳 细胞上，AngII均可使厶。电流密度减小。上述研究结果提示，An百I通过刺 激ATl受体直接引起离子通道的改变导致病理性电重构是心律失常发生 的重要原因。 哺乳类动物心室肌细胞延迟整流钾电流在动作电位复极化过程中发 挥关键作用，其中快激活成份(比)通道孔区亚单位由human 于特殊的动力学特征对动作电位形状、时程具有重要影响。疾病状况下该 通道功能下调引发动作电位时程延长和／或形状改变是室性心律失常发生 的重要原因。hERG钾通道由于本身的缺陷或者药物的影响而发生变异或 功能异常，产生先天性LQTS和获得性LQTS，均有较高尖端扭转型室性 心律失常和猝死的危险。 在前期的研究我们观察到AngII对豚鼠心室肌细胞比和表达的kRG呈 现急性抑制作用，提示AngII可能通过直接下调比参与病理条件下电生理 重构。已知AngII可激活多条细胞内信号通路引发急性和慢性生物效应， 慢性效应发生在数小时甚至更晚时间，常涉及蛋白基因转录及转录后的改 中文摘要 蛋白明显减少。那么，AngII下调通道膜蛋白含量潜在的机制尚不清楚。 新近实验证明，慢性刺激一些G蛋白偶联受体对hERG钾通道发挥明 显的转录后调节作用。因此，本研究主要利用分子生物学的方法，在前期 研究AngII作用的基础上又在异源表达系统上进一步研究ATl受体刺激对 hERG钾通道的转录后调节作用(包括如何影响hERG钾通道蛋白正向转运 及膜蛋白入胞降解等转录后调节过程而改变细胞膜蛋白含量)并对AngII 下调hERG钾通道膜蛋白量的信号传导机制进行分析，这对理解离子通道 病理重构机制从而解释心律失常发生机制具重要理论意义。 第一部分血管紧张素II对hERG钾通道转录后调节作用 目的：研究AngII对hERG钾通道转录后的调节作用。 2000瞬时转染：将ATl受体质粒转染到稳 方法：(1)Lipofectamine 的比例瞬时转染到脏K293细胞上。 (2)细胞免疫荧光：将细胞用4％多聚甲醛固定后，用O．2％％ton X．1 的封闭液进行封闭，加入特异性一抗和FITC标记的二抗，用共聚焦显 微镜观察显色情况。 (3)W|estem 转移到NC膜上，用TBST配制含5％脱脂牛奶进行封闭，加入特异性一 抗和红外荧光标记的二抗，用双色红外激光成像系统仪器扫描。 (4)111一ceU 5％脱脂牛奶封闭，加入特异性一抗和红外荧光标记的二抗，用双色红外 激光成像系统仪器扫描。 结果：(1)W|eStem 、t 达。 孵育24小时后In．cellwestem检测显示膜上成熟蛋白减少为(69％士4％， PO．01)；细胞免疫荧光染色共聚焦显微镜下观察通道蛋白在细胞膜和细 胞内分布情况，发现AngII使未透化处理过的细胞膜上的荧光明显减少， 中文摘要 透化处理过的细胞膜荧光减少，胞浆荧光变化不明显。 westem 正向转运。