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DNA含量测定方法
DNA及RNA含量测定方法
一、光密度测定法 ?[原理] ? DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰,利用这个原理我们测其OD260,再推算出其浓度。
一、光密度测定法
[原理]
DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰,利用这个原理我们测其OD260,再推算出其浓度。
[仪器]
分光光度计(紫外可见光两用)。
[试剂]
水,DNA或RNA溶液。
[操作]
(1)取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到lml。
(2)用lml水做空白。
(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。
(4)每ul中DNA或RNA浓度(ug)将是OD值的10倍,例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2,则原DNA或RNA样品浓度为2ug/ul。
(5)如果想要检测样品的纯度,那么还要再测一次280nm处OD值,计算二者的比率,若比率接近2,则说明样品中核酸比较纯。若比率小于1.6,则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中,建议再用酚/氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。
(6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质,那么还要测定一次230nm处OD值。
二、琼脂糖电泳测量法
[原理]
质粒DNA及微量DNA片段的浓度可与已知浓度的DNA同时进行电泳,根据结合的溴化乙锭荧光强度,估计其含量。
[仪器]
紫外透射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂);电泳槽;电泳梳;电泳仪。
[试剂]
6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝;40%(W/V)糖。
10×TBE电泳缓冲液:0.89mol/LTris-硼酸;0.02mol/LEDTANa2pH8.3。
0.8%琼脂糖:0.8%琼脂糖;100mi 1×TBE
5mg/mlEB:0.5gEB;100ml三蒸水
[操作]
(1)用1×TBE电泳缓冲液0.8%琼脂糖凝胶,加溴化乙锭其终浓度为0.5ug/m1。
(2)加热使琼脂糖熔化均匀,取出室温冷却至50-60℃。
(3)取一块5×7cm玻璃板,置水平台上,放一微型点样梳,点样梳底部离玻璃平板的距离为0.5-1. 0mm。
(4)将凝胶小心倒在玻璃板上,待冷却后取出点样梳,保持点样孔的完好。
(5)取DNA样品及),DNA标准浓度各lul加入1×TBE4ul,加入6×上样缓冲液lul,混
匀。
(6)在0.8%琼脂糖凝胶点样孔小心点样,记录样品点样次数与点样量。
(7)打开电源开关,电压不超过5V/cm,一般40V,30-40分钟。
(8)取出泳动后的凝胶板,翻转玻璃盖在紫外分析仪观察DNA区带。
(9)DNA含量的估计:比较待测DNA的条带与已知DNA的各条带的荧光密度,估计待测DNA在凝胶中的含量,再估计出其浓度。
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