植物组织培养第六章植物细胞培养.pptVIP

第八章 植物细胞培养（plant cell culture） 定义：在离体条件下，将愈伤组织或其他植物器官易分散的组织置于液体培养基上进行振荡培养，得到游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群（单细胞无性系）的一种技术。 意义： 1、细胞生理代谢及其影响因素研究。 2、通过单细胞克隆化，结合遗传分子生物学，进行农作物改良。 3、细胞增殖速度快，可用于次生代谢产物和药物的生产研究。 一、植物细胞培养 1、单细胞培养 ★单细胞制备方法 机械法：叶肉组织分离、吸涨的胚胎等。 酶法：利用专一的水解酶，在温和的条件下，释放出细胞。 愈伤组织诱导法：由于愈伤组织之间的结构十分松散，通过高频率振动或添加酶，可使细胞分离。 ★ 单细胞培养方法 1）平板培养 2）看护培养 3）微室培养 4）条件培养基培养 等 1）平板培养（Plating technique） 是为了分离单细胞无性系，并对不同的无性系进行研究，揭示它们在生理、生化和遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。最早是由贝格曼（Bergmann,1960）首创的。 ★平板培养的操作技术： 当含0.6％琼脂的无菌培养基冷却到30～35℃呈融化状态时，把2ml浓缩的悬浮液接种进去，均匀混合倒入9cm的培养皿中，每培养皿10ml，培养皿中培养基固化后用石蜡密封。 优点：单离的细胞在培养基中分布较均匀，也便于定点观察。 缺点：通气不好。 2）看护培养 （Nurse culture）  也称纸筏营养技术，就是用一块愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法，称看护培养。最早是由米尔（Muir 1954）创立的。 ★操作方法： 　　　在一个三角烧瓶中加入一定量的固体培养基，培养基上放一块几毫米的愈伤组织，在组织块上再放一张预先已灭过菌的滤纸，第二天把单细胞放在滤纸上培养。一个月以后单细胞可以长成肉眼可见的细胞团，2～3个月后从滤纸上取出放在新的培养基上直接培养。 3）微室培养（Micro-culture） 是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术； 最早是由德洛普（De Ropp 1955）发明的悬滴培养(Hanging-drop culture)演变而来的； 后来又发展成了多滴排列技术（ Potrykus 1979）和多室培养盘(Muotidish,Wergicke 1979)。 4）条件培养基培养（condition medium culture） 在培养基中预先加入高密度的细胞进行培养，这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使得利于单细胞或低起始密度的细胞群体有利于培养。 ★ 条件培养基制作方法： 把液体培养基培养了4~6周的高密度细胞滤掉，然后将这些液体制成液体或固体培养基，即为条件培养基。 ★ 优点：明显提高单细胞培养的成活率和分裂能力。 2、细胞的悬浮培养 1）定义：是将植物细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体培养基上进行培养，它们在培养过程中必须保持较好的分散状态。细胞悬浮培养为植物细胞培养的工业化生产开辟了新的途径。 ★优点：细胞均一、量大、增殖快速适宜于大规模培养。 ★方法类型：分批培养 （一次性生产采收提取） 半连续培养（每隔一定时间更换培养液） 连续培养（封闭型与开放型） ★ 小规模：利用培养瓶培养，震荡条件下； ★ 大规模：利用生物反应器培养，提供可控制环境条件，以满足细胞正常生长和生物合成的容器，具有搅拌和通气装置，使物料均匀混合，各组分和热量在不同相际间传递。 大规模培养包括：悬浮培养反应器 固定化细胞反应器 细胞培养技术的优点 (1)代谢产物的生产是在控制条件下进行的，因此可以通过选择优良细胞系和优化培养条件等方法得到超越整株植物产量的代谢产物。不仅节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域的限制。 (2)细胞培养是在无菌条件下进行的，因此可以排除病菌和害虫的影响。 (3)可以通过特定的生物转化途径获得匀一的有效成分。 (4)可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。 2）悬浮细胞的继代培养 每培养1~2周继代1次。 选择好接种时期（直线期末） 控制起始接种量（0.5~2.5 ×105个/ ml） 注意：继代时接种的规范操作，以免被污染 植物细胞的生物反应器大规模培养 ★ 1、细胞培养各时期特点： 延迟期(lag phase)细胞很少分裂或刚刚开始分裂。 对数生长期（logarithm phas