PCR污染的产生和防治.ppt

PCR污染的产生及防治 PCR实验室污染的特点 概念：由于各种原因，造成的PCR 扩增体系中出现了非目的检测样本本身的模板，使得PCR结果出现假阳性。 PCR实验室的污染不同于一般生物安全实验室的污染 PCR污染总是产生假阳性结果 PCR流程 样品准备（sample preparation） 反应体系配置（PCR reaction assembly） PCR反应（PCR execution） 反应后分析（post-PCR analysis） PCR污染的途径 操作错误或者误差造成的样品间交差污染 PCR试剂的污染 PCR实验器材的污染 气溶胶（Amplicon Aerosol） PCR污染的四种来源 标本或模板间的交叉污染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物的污染 实验室克隆质粒的污染 引起PCR污染的原因 标本或模板间交叉污染 容器被污染 标本或模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染 模板吸取过程中, 因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染 引起PCR污染的原因 PCR试剂污染 PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水及其他溶液等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。 引起PCR污染的原因 PCR产物污染-最主要最常见 PCR 产物拷贝量大(一般为10^13拷贝/ml) ，远远高于PCR检测数个拷贝的极限。极微量的PCR产物污染, 就可形成假阳性。 移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mix PCR产物的气溶胶污染：据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. 气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈地摇动反应管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶 引起PCR污染的原因 实验室中克隆质粒的污染 在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见 克隆质粒在单位容积内含量浓度高, 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大 PCR污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染，是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染. PCR强大扩增能力+检测的敏感性 经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题 NTC (No Template Control):必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应。 对照试验 1.阳性对照:它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，操作时需注意防止交叉污染。 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照，它包括 ①阴性标本对照（NTC）:被检的标本是血清，就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。 ②试剂空白对照（Blank）:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 主要涉及： （1）划分操作区 （2）分装试剂 （3）实验操作注意事项 划分操作区－－理想的PCR实验室分区 污染的预防 －－分装试剂 PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。 所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA。 无污染的试验器材 无污染的消耗品 PCR用水应为高压的双蒸水。 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制。 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 污染的预防 －－实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都