BCA法测定蛋白质浓度.pptVIP

李泰军 2008.06 一 实验目的 二 实验原理 三 实验材料与仪器 四 实验步骤 五 注意事项 六 思考题 一 实验目的 ◆学习BCA法测定蛋白质浓度的基本 原理 ◆掌握BCA法测定蛋白质的技术 二 实验原理 BCA (bicinchoninic acid，二辛可酸)法测定蛋白质即在碱性条件下蛋白质与Cu2+络合，并将其还原成Cu1+。Cu1+和BCA试剂反应,使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此可用于蛋白质浓度测定。 其反应式为: 蛋白质+BCA试剂+Cu2+ →复合物 混合物由苹果绿变为紫兰色复合物 BCA测定蛋白质的范围是20μg/ml~200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5μg/ml ~10μg/ml。 此方法被科研工作者广泛选用 三 实验器材与试剂 1．器材: 分光光度计；恒温水浴箱；枪式移液管；试管13支；吸管2ml 1支、0.1ml 3支 试剂: 试剂A；试剂B；蛋白质标准液；待测样品 四 实验步骤 1. 取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它各号测定管均重复做两管），按下表操作并记录： 管号 试剂(μl) 空白管 标准管 测定管 ×2 1×2 2×2 3×2 4×2 5×2 蛋白质 标准液 (1.5mg/ml) — 20 40 60 80 100 — 蒸馏水 (ml) 100 ８０ 60 40 20 — — 待测样品 (ml) — — — — — — 100 BCA工作液(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀后，在３７摄氏度下保温３０ 分钟，比色测定 BCA法测定蛋白质含量 2．以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线 3．用测定管平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，计算求出该待测血清蛋白质的含量(g/L)。 4．从标准管中选择一管与测定管光吸收值相接近者，按比色法计算公式计算求出该待测血清的蛋白质浓度(g/L)。 思考题???　 试比较ＢＣＡ法、双缩脲法、Lowery法的异同. 为什么ＢＣＡ法常用与科研？与其他方法相比它有什么特点和优势？ 特点： 1.操作简便快速，比经典的lowry法快4倍 2.灵敏度高，最低检测量可达0.5ug 3.准确，试剂稳定性好，在20ug/ml~2000ug /ml 浓度范围内有良好的线性关系 4.经济实用，可在微孔板中进行，待测样品体积为1ul~20ul，大大节约样品和试剂用量 5.抗干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质影响 谢 谢！ 放映结束 感谢各位批评指导！ 让我们共同进步