植物新基因克隆的策略与方法.pptVIP

技术流程 (1)提取两种细胞的mRNA,反转录后成为2种cDNA； (2) 以随即引物和猫定引物作随机聚合酶链反应； (3) 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带； (4)将差异DNA做成探针，或设计特异引物； (5) 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析，或进行RT-PCR和RACE扩增基因。 技术特点 ①简单，技术上仅仅依靠PCR和DNA测序胶电泳； ②可以同时分析多组样品； ③灵敏性高，仅需0.2 μg总RNA作为起始材料，可检出低丰度mRNA； ④实验周期短，约8 d即可完成，便于重复； ⑤最突出的优点是实验过程中可步步验证比较； （1）假阳性率高，假阳性的比例有时高达50％～75％。 （2）由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离，所以凝胶中的单条带可能由1种以上cDNA片段所构成。 （3）差异显示所得的cDNA片段较短，长度多在100 bp～400 bp之间，且大多位于mRNA 3′端约300 bp的非翻译区（untranslated regions,3′UTR）。 cDNA-AFLP技术 cDNA-AFLP（cDNA-amplified fragment length polymorphism）技术结合了RT-PCR和AFLP技术的分子标记技术。 原理 以