第三章+蛋白质的修饰和表达.ppt

* 二、蛋白质的位点专一性修饰 特点：试剂对被修饰基团、修饰部位具有专一性 类型 特点 应用 亲和标记 专一性标记酶活性部位 分离细胞表面受体 不可逆 光亲和标记 专一性标记酶活性部位 发现疾病相关的靶位点 不可逆 鉴别蛋白质 光反应基团 * 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 PEG特点：亲水、不带电荷 结合机制：共价结合，形成屏障保护抗原，阻止免疫反应和酶的水解 修饰方式：活化-OH（剧烈条件） 偶连基团：氨基、巯基、羧基 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、酶降解作用降低…… 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶 PEG 修饰脂质体包被的阿霉素 ? * 四、蛋白质的化学交联和化学偶联 交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。 偶联：蛋白质分子偶联到一个化学惰性的 水不溶性的载体上。 * 蛋白质的化学交联 * 蛋白质的化学交联 * 蛋白质分子固定示意图 * * 第二节 蛋白质的分子生物学改造 基因突变 定点突变 定向进化 基因融合 * 限制性内切酶 外源DNA 限制性内切酶 退火 重组质粒 转化 受体细胞 筛选 表达 带重组体的细胞 目的产物 质粒 一、目的基因的获得 目的基因 二、重组 三、重组体转入受体细胞 四、筛选和鉴定接受了重组体的细胞 五、外源基因在受体细胞内表达 * （一）定点突变 定义：改变一个或两个碱基 特点：突变率高、简单易行、重复性好 方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变 应用：纤维蛋白酶原活化剂，降低血浆清除率，延长血浆半衰期 * 1、重叠延伸PCR技术 * 重 叠 延 伸 PCR 介 导 的 定 点 突 变 * 2、快速定点突变 * 限制性内切酶 外源DNA 限制性内切酶 退火 重组质粒 转化 受体细胞 筛选 表达 质粒 目的基因 酶切割 蛋白基因 核苷酸片段 新突变质粒 * 酶切割 蛋白基因 核苷酸片段 新突变质粒 同时获得多个突变体 盒 式 突 变 * （二）定向进化（directed evolution） 范围：特定的蛋白质 条件：大量突变体、合适的筛选系统 * 1、制造突变体 易错PCR原理： 改变正常PCR反应体系 中某些组分的数量或者 质量，随即引入错误碱 基创造序列多样性的 DNA文库。 难点：适当的突变频率 DNA改组技术原理： 靶基因酶切产生随机DNA 片段，以3’-末端的片端为 引物和模板，随机互补结 合并延伸。 优点：突变率高、 适用不同物种 方法：易错PCR、DNA改组技术 * 2、筛选 方法：表型观察选择、高通量筛选 （1）噬菌体表面展示技术 概念：外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合存于噬菌体表面的技术 特点：基因型和表型统一在同一病毒颗粒内 * 噬菌体展示技术的基本原理 * （2）核糖体展示技术 原理： 该技术是基于一种稳定的抗体-核糖体-mRNA复合物的构象基础。抗体蛋白与它的编码序列物理连接。抗体基因转录，产生许多mRNA分子，每一个代表着不同抗体基因。mRNA分子与细菌的核糖体孵育，然后mRNA翻译成蛋白质。每个复合体展示一种不同的抗体，当经过一个含有靶标抗原的亲和柱子后，一些能结合上去的复合体不会被洗去，该展示技术完全在体外完成，并且不需要克隆就能完成大规模抗体库的构建。 * 二、基因的融合 概念：不同的基因或者基因片段序列构成一个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后，获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功能蛋白。 原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者多肽基因，实现两个基因的融合表达 * 基因融合的策略 1、方法 将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当的信号肽之后； 在目的基因的两端分别加上不同的亲和标签； 将目标基因插入到信号肽序列和插入序列之间 2、影响基因融合的因素： 融合蛋白接头的设计和选择 构建融合蛋白的常用技术 3、 主要应用 利用其生物学功能 利用其与受体结合的特异性，构建导向药物 问题？ * 第三节 重组蛋白质的表达 依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达体系：大肠杆菌 真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物 克隆载体