PCR、RT-PCR常见问题及分析.pptVIP

RT-PCR简介 主要内容 RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析 两步法RT-PCR mRNA 5’ 3’ AAAAAAAA Poly(A)*尾 T T T T Oligo(dT) Super RnaseH- Reverse Transcriptase T T T T AAAAAAAA mRNA cDNA T T T T cDNA 3’ 5’ 5’ 3’ PCR扩增 …… Super RnaseH- Reverse Transcriptase 3’ 5’ T T T T cDNA T T T T cDNA …… PCR扩增 5’ 3’ mRNA AAAAAAAA Poly(A)*尾 3’ 5’ 3’ 5’ 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR比较 两步法 一步法 引物 Oligo dT，随机引物，GSP GSP 优点 PCR扩增失败时便于分析原因 特异性和灵敏度高 适用 检测多种目的基因 半定量RT-PCR 大量样品分析 定性 分析基因的转录水平 获取目的基因 合成cDNA探针 RT-PCR主要用途 逆转录酶的选择 AMV： 禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃ （Bioflux公司）。 MMLV： Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛） Super RNaseH- Reverse Transcriptase MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化） RNase H的作用 水解RNA-DNA杂合链中的RNA Super RNaseH- Reverse Transcriptase MMLV反转录酶的RNase H-突变体 逆转录效率高 RT-PCR引物的选择 随机引物： 适用于长的或具有发卡 结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20μl体系50-250μg。 Oligo(dT15-18)： 适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20μl体系0.2-0.5μg。 特异性引物： 与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20μl体系1pmol。 提高RT-PCR灵敏度 分离高质量RNA 使用无RNaseH活性的逆转录酶 提高RT-PCR特异性 提高逆转录酶保温温度 减少基因组DNA污染 RT常见问题 RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5’端不全 目的基因在组织中不 表达或表达量太低 原因 对 策 分离高质量的RNA 使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux） 使用随机引物或GSP 尝试其它组织 问题1：RT-PCR没有产物 S b i o. t m m u. c o m. c n 重庆升博生物科技有限公司 升博生物 专业服务 PCR常见问题分析及解决方案 重庆升博生物科技有限公司 SHENGBO BIOTECH CO., LTD. PCR技术的发明 1983 Kary Mullis 发明 1985 开始有文章发表 1993 获诺贝尔奖 广泛用于分子生物学研究领域 pcr动画.exe PCR技术的基本原理 模板DNA的变性：93℃-95℃左右， 模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃ 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性 变性--退火--延伸三个步骤 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP 耐热聚合酶 ddH2O 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当 引物 设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量 浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融 ddH2O pH值适当，避免污染 反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP M