药学中的生物技术和方法2015-3-抗体和免疫分析.pptVIP

RIA Assay 免疫竞争结合分析---小分子抗原分析的基本方法 Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag [*AgAb: Precipitant↓] 放射性计数 常用分离沉淀技术 盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠 聚乙二醇法（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 抗体免疫沉淀法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高 固相吸附剂 RIA测量步骤 恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37℃或4 ℃温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度 Calibration curve ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） Sandwich ELISA 竞争法（略） High Convenience High Sensitivity 96-well plate 包被 封闭 结合 显色 酶标仪测定 hv 洗涤 洗涤 洗涤 终止 酶的底物 邻苯二胺(OPD) + H2O2 TMB ABTS HRP的底物 氧化产物(橙红色) 492nm吸收 2mol/L硫酸终止反应 AP的底物 硝基苯磷酸酯 对硝基酚(黄色) NaOH终止反应 405nm吸收峰 磷酸4-甲基伞酮 （荧光底物） 荧光偏振免疫分析 Principle of fluorescence polarization emitting dipole absorbing dipole ? excitation light polarized along z x z y I? I? detector Fluorescence polarization immunoassay Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag High polarized fluorescence Low polarized fluorescence 偏振度r 时间分辨荧光免疫分析 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 非特异荧光背景 1～10 Sm3+ -β-NTA 65000 人血清蛋白 4.1 Sm3+-PTA 60000 球蛋白 3.0 Eu3+-β-NTA 714000 细胞色素C 3.5 Eu3+-PTA 925000 FITC 4.5 Tb3+-PTA 96000 丹黄酰氯 14 Dy3+-PTA 1000 罗丹明B 3.0 荧光背景和常用探针分子的荧光寿命 Lanthanide labeling Lanthanide labeling Ligand labeling CTTA BCPDA 镧系荧光底物法 DELFIA法 荧光试剂标记可以消除环境中稀土污染造成的荧光背景 固相时间分辨荧光 抗体 ---生物体自造的“magic bullet” 医 疗 直接或与毒素连结攻击 病变細胞 研 究 各种免疫分析 抗体药物销售趋势图 国际抗体药物 2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。 2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元 2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元， 世界范围内的单抗药物销份额约是整个生物制药市场份额的36%。 国内抗体药物 目前我国的上市抗体品种中,国外进口单抗占据多数 2011年国内市场规模超过10亿元 我国抗体药物产业化的主要限制因素： 动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点 抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓 QbD（质量源于设计）理念的应用 抗体偶联药物(Antibody Drug Conjugates，ADC) 结合单克隆抗体的靶向性和小分子药物的高度细胞毒性，可以有效地杀伤肿瘤细胞，在临床前研究、甚至人体临床研究中，取得了良好的抗肿瘤效果，成为生物药物研