2009分子生物学实验技术3 .pptVIP

第二类(II型)限制性内切酶: 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类RE的识别和切割的核苷酸都是专一的,因此,是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个、7个、8个、9个、10核苷酸的。 II型RE的识别顺序是回文对称顺序。酶的切割可有两种结果：平头末端、粘性末端。 分子生物学实验三 BMBL * * 分子生物学实验三 Contents 质粒DNA的酶切及分析 1. 重组蛋白质表达的鉴定 2. 分子生物学课题设计 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 常规PAGE 不连续PAGE SDS固相pH梯度IEF(IPG-IEF) 双向电泳 凝胶聚合原理 化学聚合 以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。 光聚合 核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应 光照 O2 凝胶的孔径 单体和双体在凝胶中的总浓度 a+b V × 100% T＝ 双体占总浓度的百分含量，即交联度 b a＋b × 100% C＝ a，Acr的质量（g） b，Bis的质量（g） V，溶液的体积（ml） C＝6.5％-0.3T T：5％～20％ 孔径大小 蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系 蛋白质相对分子质量范围(kD) 适用的凝胶浓度（T%） ＜10 20－30 10－40 15－20 40－100 10－15 100－500 5－10 ＞500 2—5 ? 凝胶浓度的选择 不连续PAGE的分离效应 浓缩效应 分子筛效应 电荷效应 可分离： 1. 电荷性质与密度相近的但分子量有差别 2.分子量相近、性质一样、电荷与密度有差别 的分子 3.电荷性质、分子量大小相近，但构型不同 ① 浓缩效应 1.缓冲液与凝胶的离子成分和pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白质离子。快慢离子迁移快慢的差别造成电场强度与电导率的变化。低导电区和高导电区。蛋白质样品迁移率在快慢离子之间，压缩聚集成一条窄带。 2.两层凝胶的孔径不同：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶 ②分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出 gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和pH 值中泳动，依其分子量的大小而分开。 ③电荷效应 蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁移的距离的差别而到达分离。 重组蛋白在原核生物中 诱导表达的SDS鉴定 (B菌) 实验原理 SDS：消除电荷对蛋白质样品迁移率的影响，电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小。 SDS是一种阴离子去垢剂，溶液中带负电荷。 SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，蛋白质解聚为单一多肽。 蛋白质多肽与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块。 影响因素 溶液中SDS单体的浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单体浓度低于0.5 mmol/L，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L 用SDS处理样品同时用巯基乙醇或DTT处理，完全还原蛋白质内的二硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 实验试剂和器材 1.材料： 低分子量标准蛋白：  兔磷酸化酶B MW=97,400  牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 2. 试剂（略） 12％分离胶的制备：15ml ddH2O 4.8 ml 30%凝胶储存液 6.0 ml