免疫的标记技术.ppt

一、原理与方法 （一）原理 放射免疫分析法（radioimmunoassay RIA） 应用竞争性结合的原理，应用放射性同素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果。 本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。 放射免疫标记技术常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ 1、液相法 将待检标本（例如含胰岛素抗原）与定时的同位素标记的胰岛素（抗原）和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。 放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种 （二）方法 2、固相法 将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体测定固相载体的放射活性。常用的固相载体有溴化氰（CNBr）海豹化的纸片或聚苯乙烯小管。 二、放射免疫分析加样程序 （一）放射免疫分析顺序饱和加样程序 1、基本原理 先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。 2、加样程序 以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例 （直接测定）。 （1）加样（单位μl；总反应体600μl）。 （2）孵育：4℃，24h。 （3）分离B与F。无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共两管，离心、去上清。血浆5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡10min，再离心，取上清，即无肽血浆。 （二）放射免疫分析平衡饱和加样程序 1、基本原理 所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到即不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。 2、加样程序 一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。 以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例： （1）加样（单位μl；总反应体积500μl）。 （2）孵育：4℃，24h。 （3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的cpm数。 三、放射免疫分析的质量控制 （一）质量控制的目的和内容 1、在一个测定方法内产生的误差。 2、在同一实验室内不同方法之间产生的误 差。这两种情况属于内部质量控制。 3、用同一测定方法，在各实验室之间产生 的误差。 4、采用不同方法，在各实验室之间产生的 误差。后两种情况属于外部质量控制。 （二）产生测量误差的因素 （三）放射免疫分析中测量误差的控制 1、选择准确性高的方法 2、建立方法对比 3、建立各种类型的标准。如规定标准品的 纯度、制备方法、使用年限及使用条件 4、建立操作规程，按规程操作 5、建立可靠的检查制度 四、标记抗原的放射免疫技术（RIA） （一）原 理 将标记抗原和未标记抗原一起加入相应的抗体时则两种抗原产生相互的竞争，而生成有标记抗原和抗体复合物以及非标记抗原和抗体复合物。二者含量在一定限度内呈反比，利用此法可测定未知抗原或抗体。 抗体为限量的 （二）放射免疫抗原的制备 1、完全抗原? 为了保证免疫反应的特异性，放射免疫抗原纯度必须在90%以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。 2、半抗原? 要获得较好的免疫原性，必须将半抗原与蛋白质大分子的载体结合起来形成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等 （三）抗体的制备与提纯? （四）抗原的标记 1、放射性同位素的选择? 选择同位素的原则： ⑴ 方法简单、经济、便于推广应用。 ⑵ 易于防护。 ⑶ 同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。 ⑷ 对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。 ⑸ 具有较高的计数效率。目前常用的同位素有3H、125 I，其它还有14C、35S和32P等。 同位素 毒性分类 半衰期 3H 14C 131I 125I 35S 32P 低毒 低毒 高毒 低毒 中毒 中毒 12.26年 5730年 8.07天 60.20天 67.48天 14.26天 2、标记方法?