091第二次讨论第三小组.pptVIP

酶分离纯化中的注意和酶活、酶比活力、回收率测定 组员：彭少杰、王大亨、方言康、姜兰 PPT制作人：姜兰 演讲者：方言康 在酶分离纯化过程中，一个非常重要的问题是保护酶的活性，不使酶在纯化的过程中失活，因此酶提取纯化应注意以下问题： 　1） pH值　 　2） 温度　 　3） 防止氧化　 　4） 避免重金属污染　 　5） 蛋白酶的污染 　6） 介质的极性和离子强度 酶活力（enzyme activity） 也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。 酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。 如何测定酶活力？ 以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降 酶的比活力 指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数 回收率 产率(回收率) = 每次总活力/第一次总活力×100% 纯化倍数 = 每次比活力/第一次比活力 * * 分离纯化注意事项 测定内容 酶活力 酶比活力 酶活回收率 比例表 选择酶最稳定的pH值，确定合适的缓冲容量的缓冲溶液 一般来说0℃时酶比较稳定，一般在0～4℃时操作；但有例外，如丙酮酸羧化酶，在0℃时不稳定，而在260℃时稳定 多含—SH，可加入β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等进行保护 主要注意溶液的配制，亦可加入EDTA络合去除 加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氟）、DFP（二异丙基氟磷酸）或胰蛋白酶抑制剂 加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氟）、DFP（二异丙基氟磷酸）或胰蛋白酶抑制剂 So 酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。 0 产物浓度 时间 为什么初速度 的测定是关键？ 0 原 因 底物浓度的降低、 产物的增加造成 的逆反应的加快； 产物的抑制作用； 酶本身逐渐失活 产物浓度 时间 比活力 ＝ 酶活力单位数（U） 酶蛋白质量（mg） 比活力是酶制剂纯度的常用指标 —— 比活力越大，表示酶越纯 15.10 23.07 751.56 2209.60 2.94 Sephadex G-75层析 2.60 41.66 127.92 3991.20 31.20 硫酸铵分级层析 1 100.00 49.74 9576.20 192.60 粗酶液 纯化倍数 回收率/% 比酶活力/(U/mg) 总酶活力/U 总蛋白质/mg 仙人掌SOD的纯化结果