耳聋相关的线粒体trnaserucn7505t值c突变的细胞功能.docxVIP

温州医科大学硕士学位论文耳聋相关的线粒体tRNAser(UCN)7505TC 温州医科大学硕士学位论文 耳聋相关的线粒体tRNAser(UCN)7505TC 突变的细胞功能研究 中文摘要 众多社会公共卫生问题中，耳聋是非常重要的一种，对社会和个人都会造成 巨大的经济负担并且会严重影响人们的生活。线粒体DNA突变是引起耳聋的重 要原因之一。本研究通过对一个携带线粒体tRNASer(UCN)7505TC的中国汉族母 系遗传耳聋家系进行临床、分子遗传学及细胞生化等特征的评估，深入探索耳聋 相关的线粒体tRNASer(UcN)7505TC突变对细胞功能的影响。 听力筛查和临床资料分析发现，该家系中9位母系成员中有7位是耳聋患者， 其他成员表型正常，耳聋是该家系唯一临床表型，并且呈现母系遗传特征。线粒 体基因组全序分析发现，该家系线粒体tRNASer(UCN)7505位点存在TC同质性 突变，单体型为F1。线粒体tRNAser(UCN)的7505位点突变位于tRNASerCOCN)D．stem 的第二个碱基。该位点突变破环进化上高度保守的碱基配对(10A．20U)，可能会 影响到tRNAser(UCN)二级结构的稳定性。 我们将含有先证者和正常对照线粒体的血小板与人类mtDNA缺乏的p 0206 细胞进行融合，构建成功的融合细胞系属于同一单体型，具有相同核背景。筛选 获得的融合细胞通过mtDNA鉴定之后，通过分子水平、细胞水平的一系列实验 对其tRNA代谢、线粒体蛋白合成、线粒体氧化呼吸、ATP生成、ROS产量及 膜电位(ATm)进行分析。 Northern blot分析显示，与对照组细胞系相比，携带m．7505TC突变的细胞 系的线粒体tRNAser(UCN)水平下降了～61％(P=0．0359)，而其他tRNA水平并无显 著改变。提示m．7505TC突变可能破环了进化上高度保守的碱基配对(10A．20U)， 进而影响到tRNAser(UCN)二级结构的稳定性，使tRNASer(ucm的稳态水平降低。 tRNASer(UCN)代谢紊乱可能会导致突变组细胞的部分线粒体蛋白合成水平下 降，通过Western blot免疫印迹实验对线粒体基因编码的6个多肽的表达水平进 行了检测，与对照组相比，突变组的C01、C02和ND5的表达水平下降了-40％ (尸=D．0039)、～91％(P=D．0182)和～45％(P=0．0207)，而其他两种蛋白表达 水平无显著下降。 线粒体蛋白是氧化呼吸链复合体的组成成分，部分线粒体蛋白质合成障碍可 能会影响一些复合体的合成，最终导致线粒体氧化呼吸链损伤。因此我们对线粒 体氧化呼吸链复合体酶活性进行检测，经测定，与对照组相比，突变组线粒体氧 万方数据 温州医科大学硕士学位论文化呼吸链复合体III、复合体IV活性下降了~47％(尸=D．0056)、～64％(尸=D．0167)。 温州医科大学硕士学位论文 化呼吸链复合体III、复合体IV活性下降了~47％(尸=D．0056)、～64％(尸=D．0167)。 氧化呼吸损伤将会造成线粒体功能改变，进而影响细胞的正常功能，因此， 我们对细胞内活性氧水平、ATP产量、线粒体膜电位等进行了检测。与对照组相 比，突变组细胞中活性氧的产量平均增加了80．12％(尸=D．0031)，膜电位水平 下降了-42％(P=0．0194)，ATP产量下降了-26％(尸=n0070)。 总之，m．7505TC突变导致线粒体tRNASer(UCN)稳态水平的降低可能不能满 足一些线粒体蛋白质合成的需要，而线粒体蛋白是氧化呼吸链复合体的组成成 分，线粒体蛋白合成缺陷将会导致线粒体呼吸链和氧化磷酸化的过程受到损伤， 进而表现为细胞某些功能异常，使得活性氧的产量增加，膜电位水平和ATP产 量下降了，不足以维持耳蜗细胞的正常功能，最终导致耳聋表型。 【关键词】耳聋，线粒体tRNASer(UCN)，母系遗传，细胞功能 万方数据 温州医科大学硕士学位论文AB 温州医科大学硕士学位论文 AB STRACT Deafness is very impotant in the major public health problems．There are enormous financial and personal toll that hearing loss takes on people and society．Mutations in mitochondrial DNA(mt DNA)have been found to be one of the important causes of nonsyndromic sensorineural hearing loss．We report here the