双向电泳实验步骤.pptVIP

双向电泳 双向电泳 一、双向电泳原理 二、双向电泳样本制备 三、第一向电泳—IEF电泳 四、胶条平衡 五、第二向电泳—SDS六、双向电泳凝胶染色 七、双向电泳图片分析 双向电泳 一、双向电泳原理 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是基于蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳——等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳——十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。 二、双向电泳样本制备 二、双向电泳样本制备—动物样本 二、双向电泳样本制备—植物样本 二、双向电泳样本制备—植物样本 三、第一项电泳—IEF电泳 1：蛋白质定量,根据定量所得的数据吸取相应量的蛋白质，分析胶的一般上样量为银染120μg，考染600μg，质谱胶的一般上样量为银染200μg，考染1200μg。将所有样品稀释成5μg/μL 。 2：每根胶条的上样液的成分为：相应量的蛋白质、1%DTT、1%IPG Buffer、1×溴酚蓝、RB调制最终体积至460μL。将样品溶液混合均匀后，4℃ 12000r/min，离心20min，吸取上清液450μL进行泡胀。 3：取出水化盘，在底下铺上白色纸巾（方便观察胶条泡胀情况），调节水平备用。从冰箱取出干胶条复温（如不复温胶条会吸潮）。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，450μL样液可分3枪加入，第一二枪每枪吸160μL，从槽顶端开始，沿左右边缘加入，将样液加成一条细线，长约22cm，第三枪吸至管中样液剩余20μL左右即可，加至槽的顶端，将顶端部分覆盖满。调节室内温度为20℃，让胶条泡胀过夜（10～12h）， 4：等点聚焦（IEF),等电聚焦程序为：S1 stp 300V 20min, S2 stp 700V 30min, S3 stp 1500V 1.3h, S4 grd 9900V 3h, S5 stp 9990V 5.3Hr, S6 stp 600V 20h 5：跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，胶条应置于-20℃保存。如果需要运输，则要用冰完全包埋平衡管保温。 四、胶条平衡 1：作用 DDT与IAA联合使用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带上负电荷以利于第二向SDS电泳。 2：实验步骤 （1）：取出放置有胶条的平衡管，每管加入10mL左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，去掉去离子水。 （2）：SDS平衡液加入100mM DTT混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （3）：SDS平衡液加入250mM IAA混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液。 （4） SDS 平衡液： 50mM Tris-HCl (pH8.8)， 6M Urea (FW 60.06)，30%(v/v) Glycerol (87% v/v)，2% (w/v) SDS (FW 288.38)，0.002%(w/v) Bromophenol blue。 注：在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好 五、第二向电泳—SDS电泳 1、根据实验分离片段大小选择不同浓度的PAGE胶： 五、第二向电泳—SDS电泳 4: 电泳 （1）用1x电泳缓冲液配制1%的低熔点琼脂糖45mL，1%的普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1X后放于泡沫盒中备用，吸取低熔琼脂糖封住SDS整个胶面。迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡。 （2）依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，避免玻璃板下端产生气泡。装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1%普通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电。在上槽中轻轻地加入上槽液（2 x 电泳缓冲液）至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液（1 x 电泳缓冲液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电