树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响研究.pptVIP

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究 张恒辉 何豫 赵鸿 朴文花 刘茂昌 席宏丽于敏 王贵强 北京大学第一医院感染疾病科 研究背景 研究背景（1） 研究背景（1） 关于恢复DC功能的研究 研究目的 本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化，并辅以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增强DC的成熟和功能。 将患者DC经HBV core18-27肽负载后，刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。 研究对象和方法 研究对象 22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。 HBeAg+患者16例、 HBeAb+患者6例。HBV DNA 均≥104 copy/ml。 排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。 研究方法 HLA-A2型别鉴定 DC的体外培养扩增及鉴定 以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性T细胞 Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8 + T 细胞 HLA-A*02型别鉴定 外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗； 流式细胞仪检测； 每份标本均设自身阴性对照。 树突状细胞的体外培养扩增及鉴定 分离病人PBMC； GM-CSF、IL-4 刺激下DC培养转化； Poly(?I:C)刺激； 通过流式细胞仪检测DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表达，进行功能及成熟度的鉴定。 以DC为抗原递呈细胞体外诱导HBV抗原特异性T细胞 培养成熟DC负载HBV 核心肽（HBV core18-27 FLPSDFFPSV）； DC与自体T细胞共培养48-72h； 单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组为对照。 Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数 封闭 种板 孵育：37℃，5% CO2 孵育15-20 h； 显色 计数：CTL IMMUNOSPOT分析仪计数，取两复孔的平均值 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8 + T 细胞 PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8标记； 流式细胞仪检测； 慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV 四聚体标记作为阴性对照； 统计学处理 实验数据以?x±SD表示。用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用配伍组方差分析。 结 果 DC的扩增、表型鉴定及Poly (I:C)对其表面分子表达的影响 Poly(I:C)对DC表面分子表达的影响 经Poly(I:C)刺激后： CD80、CD83表达明显上调。 CD14的表达明显下降 。 Elispot检测HBV特异性的分泌IFN-γ 的CTL细胞频数的比较 Elispot检测结果说明 病人T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比，分泌IFN-γ 的CTL细胞频数均值由16上升为46，约为2.9倍； 发现经Poly（I:C）作用后的树突状细胞所活化的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数明显升高，均值为98，和未经树突状细胞刺激组和树突状细胞刺激组相较，分别升高6.1和2.1倍。 Tetramer 结果说明 患者T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比， HBV core18-27 肽特异的CTL频数均值由0.77 %上升至1.92%，提高约2.5倍，差异均有统计学意义（ P ＜0.001）。 经Poly（I:C）刺激的树突状细胞活化后，HBVcore18-27 表位特异性CTL的频数均值上升为3.49 %，分别为前2组的4.5和1.8倍，差异均有统计学意义（P值均小于0.001）。 讨 论 讨论（1） 树突状细胞能激活幼稚T细胞，调节T、B淋巴细胞的功能；在病毒抗原摄取、递呈及特异性激活抗病毒免疫反应中发挥重要的作用，是抗感染免疫的中心环节。 HBV急性感染时：多克隆、高反应性的病毒特异性CTL——可迅速、彻底清除病毒； HBV慢性感染时：单一克隆、弱反应性的病毒特异性CTL。 讨论（2） 聚肌胞Poly(I:C)是一种Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的强诱生剂。 Poly（I:C）能够有效地诱导体外单核细胞转化的树突状细胞成熟，并维持树突状细胞的成熟状态 。 CD83：DC成熟；行使功能 CD83表达 DC成熟及功能改善 CD14：单核细胞的特异性分子标记 CD14表达 DC分化程度改善 讨论（3） MHC-肽四聚体染色