第四章基因操作的主要技术.pptVIP

不对称PCR 限制性引物 高浓度引物 4、“巢式”PCR （nested PCR,NPCR） 先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR技术即巢式PCR。第一次扩增引物称外引物，第二次扩增引物为内引物。 外引物设计长一些，且其用量较大，采用较高复性温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。经过若干循环后，外引物基本耗尽，只需降低复性温度即可直接进行内引物的PCR扩增。这种技术被称为“中途进退式”PCR。“巢式”及“中途进退式”PCR主要用于极少量的模板的扩增。 5、RACE-PCR （rapid amplication of cDNA end PCR) 通常在已知某基因cDNA中间一段序列时，为了获得其cDNA全长，所进行的一种cDNA末端扩增的方法即快速cDNA末端扩增PCR（RACE-PCR）。包括3，-RACE法和5，-RACE法两种。 6、复合PCR （compoud PCR,CPCR） 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段的方法称为复合PCR。主要用于同一种病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。 7、锚定PCR（anchored PCR） 用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3，端加一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增。可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 8、原位PCR（in situ PCR） 利用PCR技术在细胞涂片或组织切片上直接对靶DNA片段进行扩增，然后用原位杂交细胞或组织技术进行定位，即为原位PCR。其敏感性可以达到显示单个拷贝基因信号的程度。快速、灵敏、特异性高，有直接原位和间接原位PCR两种。 9、随机扩增多态性分析（RAPD，random amplified polymorphic DNA） 基因组的比较研究：应用细胞的总DNA，进行随机引物PCR分析，能够测定出两个生物体（不论是两个不同的物种还是同一物种的两个不同个体）基因组之间的差异。两个物种的个体之间，亲缘关系越近，其相应的PCR扩增带型就越相似，反之差异也就越悬殊。 如：以10个碱基作引物用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖电泳后所呈现的带型，反映着用作模板的DNA分子的总体结构特征。 RAPD（random amplified polymorphic DNA) 4.3 分子杂交技术 分为核酸分子杂交（Southern及Northern杂交）和蛋白质分子的“杂交”（Western 杂交）。 核酸分子杂交（molecular hybridization, DNA/DNA or DNA/RNA）技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是：互补的核苷酸序列通过碱基互补配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为杂交。杂交的目是用标记的探针检测出DNA或RNA同源序列。此杂交过程是高度特异性的。可用来检测特定生物体间是否存在亲缘关系. DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。 核酸探针的标记：探针必须经过标记，以便示踪和检测，探针标记有切口平移标记和随机引物标记两种方法。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。视频 核酸杂交常用几种膜的性能比较 将待测样品固定在固相支持物上 膜上印记（尼龙膜或硝酸纤维素膜）杂交的步骤： （1）. 核酸印迹转移：用印迹技术将待测的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段保持其原来的相对位置不变.主要有：电泳核酸凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法； （2）. 印迹杂交：用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。 1、萨瑟恩DNA （Southern） 印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。 由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素