试验三培养基的制备灭菌及生活饮用水中细菌总数测定.doc

实验三 培养基的制备灭菌及生活饮用水中细菌总数测定 一、实验目的和要求 掌握微生物培养基和无菌水的制备方法；学习实验器材及培养基等灭菌方法。 验证性实验，实验时数可安排为2学时。 二、实验设备与仪器 1．培养皿15-20套，试管6支-10支，移液管10 mL 1支，1 mL 2-4支，锥形瓶2个，烧杯300 mL 1个，玻璃珠。120 mL三角瓶1个。 2．纱布、棉花、牛皮纸、报纸、细铁丝、厌氧袋。 3．pH试纸6-8（或pH仪）、10% HCl、10% NaOH。 4．牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。 5．高压蒸汽灭菌装置、烘箱、电炉、冰箱、净化工作台。 三、实验前准备工作 1. 预习实验指导书实验三的内容。 2. 复习课堂教学有关微生物营养和培养基制备原则，微生物的灭菌原理等内容。 四、实验注意事项 1. 实验过程中使用高压灭菌装置应严格按照操作规程进行，才能达到灭菌效果。使用时应注意安全操作。 五、实验原理 灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和其芽孢（或孢子）。消毒是用物理、化学因素杀死病原微生物和部分微生物。 灭菌方法有高温灭菌、紫外线灭菌、超声波灭菌、灼烧灭菌等，消毒方法有化学试剂消毒、过滤消毒等。 高温灭菌是主要灭菌方法。高温灭菌常有两种方法，干热灭菌和高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌时湿热的穿透力和热传导强，湿热时微生物吸收高温水分，菌体蛋白容易凝固变性。高压蒸汽灭菌的温度是121oC，灭菌15-30分钟；干热灭菌温度是160 oC，灭菌2小时。 六、实验内容 1．玻璃器皿的洗涤和包装，灭菌前的准备工作； 2．为下个实验制备所需的培养基和无菌水； 3．学习高压蒸汽灭菌技术； 七、实验方法与步骤 1. 玻璃器皿的洗涤与包装 （1）洗涤：培养皿、试管、三角瓶用毛刷蘸洗涤剂洗刷→ 用自来水冲洗干净，不挂水珠为止→ 105℃烘箱烘干，待用。 移液管先用洗液浸泡→ 用镊子取出→ 自来水冲洗干净→ 烘箱烘干备用。 （2）包装： 1）培养皿15-20套，用牛皮包装→棉线包扎→待灭菌； 2）移液管包装：移液管10 mL 1支，1 mL 2支→ 移液管的吸入端用铁丝塞入少许棉花→约1-1.5 cm 长棉签→ 用4-5 cm宽的长纸条从一方向包裹移液管至另一端→ 多余纸打结，以达密封效果； 3）试管、三角瓶的包装：取试管5-10支，在试管和瓶口加棉塞→ 棉塞插入瓶口中2/3，试管用报纸包装→ 棉线包扎→ 待灭菌。 2.培养基制备 （1）配制溶液：按实验中培养微生物种类选取培养基配方。 例，营养琼脂培养基的配制： 在天平上称量：蛋白胨1克，牛肉膏0.3克，氯化钠0.5克→ 放入300 ml烧杯中→加100 ml蒸馏水→ 在电炉上加热，用玻棒不断搅拌溶解→ 加入1-2克琼脂→ 加热不断搅拌至溶解。 （2）用蒸馏水补充因蒸发损失的水分。 （3）用10% NaOH或10% HCl调培养基pH=7.4-7.6； （4）过滤：乘热用纱布或药棉在漏斗中过滤培养基→ 分装在三角瓶中加塞→ 待灭菌。 要求：配制细菌培养基、真菌培养基、放线菌培养基、厌氧培养基等。 3.无菌水制备 三角瓶中加200 mL自来水→ 加数粒（10-30粒）玻璃珠→ 加棉塞→ 用纸包装→ 待灭菌。 4.灭菌方法 （1）高压蒸汽灭菌 1）加压前的准备工作 高压锅内加水至水位线→ 放入待灭菌的器皿和培养基→ 盖上灭菌器盖→ 打开排汽阀→接通高压锅电源→ 锅内水沸腾→ 驱净锅内冷空气→ 排气口蒸汽猛烈且微带蓝色→ 关闭排气阀→ 加压。 2）加压：关闭排气阀→ 压力表上压力上升至1.05 kg/cm2，温度121℃，开始灭菌→恒温至15-30 min→ 关闭电源，灭菌结束。 3）待锅内温度降至室温时→ 打开放气阀→ 打开锅盖→ 取出灭菌的物品（注意不能将包装纸折开，否则已灭菌物品会重新被污染！） （2）高温干热灭菌 玻璃器皿和金属器皿包装→ 烘箱160℃烘2 h→ 关闭电源→ 待温度降为室温取出已灭菌的物品。 （3）灼烧灭菌 接种环：接种针或瓶口可在酒精灯火焰上灼烧达到灭菌效果。 5. 细菌总数的测定 （1）生活饮用水中细菌总数的测定 1）以无菌操作方法用灭菌移液管取1 mL自来水样至灭菌的培养皿中，加入15 mL约45℃营养琼脂培养基，立即旋摇平皿。 2）同时，再做一个平行样和一个空白样。 3）待培养基凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37恒温箱培养24小时，进行菌落计数，即为1 mL水样中的细菌总数。 八、实验数据整理 1．配制培养基成分实验记录，见表3.1 表3.1 配制培养基成分实验记录 序号 培养基成分名称 数量 备注 pH 2．高压蒸汽灭菌的实验条件记录，见表3.2