第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选.ppt

第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选;第一节 受体细胞;2.受体细胞选择所应遵循的原则;受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。;3.各种类型受体细胞的优缺点;■缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的RNA转录后加工、修饰系统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。 ■常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。 大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。 细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的。 枯草杆菌：基??背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因;表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培养。 蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。 （2）真菌细胞 真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。 （3）植物细胞 优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳定遗传的转基因植物。;缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。 方法：（a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。 （b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。 （4）动物细胞 ■优点： 动物细胞具有RNA的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。 易被重组质粒DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。 可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。 ■缺点： 不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。;第二节 重组DNA分子导入受体细胞;电穿孔转化法 其基本原理是利用电穿孔仪的高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间的通道，从而促进外源DNA的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源DNA浓度的影响。 三亲本杂交接合转化大肠杆菌 ■转化率的计算及其影响因素 转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。 转化率 = 转化子数 / DNA分子数 （10-5表示105个DNA分子获 得一个转化子） 或 转化子数 / DNA质量（106/μg表示1 μg DNA分子得106个转化子）;影响转化率的因素 a：重组DNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞的亲和性。 b：菌株类型 c：转化方法：电穿孔法最高，CaCl2诱导法居中，三亲本杂交接合法最低。 （2）重组λ嗜菌体DNA分子转导大肠杆菌 ■转染（transfection）及转导（transduction） 转染：将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。 转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。; 采用λ噬菌体DNA直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对重组的λ噬菌体DNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染大肠杆菌。 ■体外包装 体外包装：在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。 原理：根据λ噬菌体DNA分子体内包装的途径，分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的λ噬菌体突变株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，都不能单独的包装λ噬菌体DNA。但将两种突变株分别感染大肠杆菌后，从中提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包装物（含D蛋白），两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。;2.重组DNA分子转入真核细胞 由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂，适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生物。但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因方法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。 （1）重组DNA分子导入植物细胞 ■农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒-Ti质粒的T-DNA能转移至细胞内部。因此，将外源基因与Ti质粒重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。;■多聚物介导法 一些多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二价阳离子（Ca2+、 Mg2+、 Mn2+等）于DNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细