荧光定量PCR原理及应用(科研版).pptVIP

实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？？？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化 实时荧光定量PCR原理 在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值 实时荧光定量PCR原理 定量原理 Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数 实时荧光定量PCR原理 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 实时荧光定量PCR原理 阈值的选择 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 实时荧光定量PCR原理 为什么要用Ct值定量 实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚