把重组DNA分子引入受体细胞.ppt

实验原理 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 。 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 转化子的筛选和鉴定（检） * * 实验五 大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化 一、什么是转化 转化(Transformation)最初是一个遗传学的名词：细菌的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。（是一种现象） 转化：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段 。在基因克隆技术中，转化特指以质粒DNA或以质粒为载体构建的重组子导入细菌的过程。（是一种技术手段） 以往实验内容的回顾及串连 1、DNA的提取：获取PCR的模板 2、PCR：DNA片段的特异性扩增。 3、质粒的提取：基因载体的获得 4、限制性内切酶分析及DNA的回收：DNA的重组 5、质粒的转化： 重组子（Transformant）的筛选。 质粒的扩增。 基因工程(Gene Engineering)是一种DNA重组技术，即把供体细胞中的基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，转移到受体细胞并获得新的遗传特性的技术。 DNA Protein 基因工程的基本操作程序包括： (1)目的基因的分离及扩增。 (2)用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工处理，把 目的基因与载体结合成重组DNA分子； (3)把重组DNA分子引入受体细胞。 (4)转化体细胞的扩增； (5)重组体细胞的鉴定与筛选。 基因工程的操作过程 切 接 转 增 检 感受态细胞： 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。 转化是一个DNA进入细胞的过程： 妨碍DNA进入细胞的因素 （1）分子大小与细胞孔径 （2）电荷间的斥力 （一）受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。 （二）感受态细胞的制备 将1ml培养液转移到1.5ml Eppendorf管离心管中，在冰上放置10分钟，然后4000r/min，4℃离心10分钟。 弃上淸，倒置离心管流尽剩余液体，每个管中各加入0.2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟。然后4000r/min，4℃离心5分钟，回收细胞。 弃上淸，每1ml的原培养液再加入100μl冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。 （三）感受态细胞的转化 1、在50μl上述感受态细胞悬液中，加入1μl DNA溶液。 2、将上述各样品轻轻摇匀，冰上放置5分钟后，于42℃水浴中保温90－100秒，热休克，促进细胞吸收DNA复合物，然后迅速置于冰浴中冷却5分钟。 3、取上述溶液全部涂布于含抗菌素LB平板培养基室温下放置20分钟，待溶液被培养基完全吸收后，倒置平皿，于37℃恒温培养箱内培养12小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时，停止培养。 转化效率的衡量 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后的单菌落数即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长） 转化率 转化率的影响因素 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质： 不同的载体转化同一株