实时荧光定量PCR-肖晓秋2010-11-12.pptVIP

?绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 ?相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 实时荧光定量PCR法：绝对定量与相对定量 绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?PCR的产物 绝对定量：从荧光到拷贝数 实时荧光定量PCR法:相对定量通过内标定量 内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 实时荧光定量PCR法:相对定量-参照因子 Calibrator 实时荧光定量PCR法--相对定量分析方法1: -ΔΔCt 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏 差在5％以内: 1、用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值： ΔCt（test)= Ct （target,test) - Ct （ref,test) ΔCt（calibrator)= Ct （target, calibrator) - Ct （ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCt值归一试验样本的ΔCt值： ΔΔCt= ΔCt（test) - ΔCt（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCt=表达量的比值 实时荧光定量PCR法--相对定量分析方法2： 双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同： 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 实时荧光定量PCR法：实验要素1--样品 ●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL 实时荧光定量PCR法：实验要素2--标准品 * 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 肖晓秋 重庆医科大学生命科学研究院 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR原理：实时原理 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理：实时原理 实时荧光定量PCR原理：定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR 原理 -- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量PCR 原理 ---荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧