聚合酶链反应原理及实际应用.ppt

一、概念 （一）PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的双链DNA为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，以四种dNTP为底物，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，经过变性、退火、延伸的循环快速特异地扩增出特定的DNA片断。 简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1、引物长度 一般为15-30个mer，一般为20～27mer。 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 2、 （G＋C）含量 GC含量一般40-60%，一般 50%。 引物Tm值一般要求：55℃-65℃。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2(A+T) 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性； GC含量太高也易于引发非特异扩增。 6、引物3′端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。 考虑到密码子的简并性，引物3′端不终止于密码子第三个碱基。 3′端不能选择T ，最好选择A 。 7、引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列和保护碱基。 5’端的修改某个碱基，引入该位点的点突变。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 8、引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，与非特异性扩增基因同源性应小于70％。 引物设计软件 Primer Premier 5.0 6.0 生物软件网下载 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer 引物同源性分析 用Blastn软件进行同源性比较 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物 选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物 选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源的序列作为引物 （四）模板 102～105拷贝，人DNA 1μl / 3×105单拷贝 纯度要求不严格 不能混有SDS、有机溶剂酚、氯仿等蛋白质变性剂 （五）石蜡油 防止蒸发 现在PCR仪不用 （六）引物 上下游引物均衡， 1μl / ml 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 六、引物的设计原则 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。 PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。 → ← 3’ 3’ 5’ 5’ Sense primer Antisense primer 引物设计好坏与PCR结果密切相关 3、 碱基的随机分布 A 、T、 C、 G 4 种碱基随机分布 同一碱基连续出现不应超过4个 4、引物自身不应存在互补序列 引物自身形成发夹结构，会因空间位阻而影响其与模板结合。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ATACAGT— — —GTAT T A G C A T A T G T A 5、两引物之间也不应互补 尤应避免3′端的互补，以防止引物二聚体的形成。 引物之间不能有连