实验用组培和转化方案.docx

本实验室用的水稻遗传转化程序 愈伤组织的诱导： 去売的水稻种子，经70%乙醇浸润30秒后，灭菌水洗涤1次，然后用1%次氯酸 钠溶液消毒20min,灭菌蒸憾水洗涤4次，无菌滤纸吸干多余水分后，将种子置于 愈伤组织诱导培养基上，28 °C黑暗下培养。经常检查污染情况，3-4周后诱导愈 伤出现。 诱导培养基配方如下： N6大量 B5微量 B5有机 B5铁盐 脯氨酸 2g/L 水解酪蛋白300mg/L 2, 4-D 2. 5 g/L 蔗糖 30 g/L 愈伤组织的继代： 当胚性愈伤组织从种子盾片处生长岀来后，选择颜色鲜黄，质地致密的直径 1-2価的球型愈伤组织，置于愈伤组织培养基2±, 28°C、黑暗下继代培养，每 4周继代一次（7B培养基）；不要用继代5次以上的材料做转化材料 2, 4-D和L-脯氨酸的浓度分别调整为2mg/L和0. 5g/L） 继代培养基配方如下 N6大量 B5微量 B5有机 B5铁盐 水解酪蛋白 300 mg/L 脯氨酸 0. 5 g/L 2, 4-D 2 g/L 蔗糖 30 g/L 农杆菌的转化: (I)取生长健壮的愈伤组织转入新的NB培养皿中(25-30个/皿) ⑵ 第3天，将经活化的农杆菌于液体培养基中，28°C、200r/min培养至OD600二0.6左右, 离心收集细菌重悬于等体积的NB培养基中，加入终浓度为100umol/L的乙酰丁香酮, 作为侵染液。 ⑶ 收集生长旺盛、状态良好的直径2-3mm的愈伤组织，放于上述侵染液中，lOOr/min振 荡培养20min,静置lOmin后取出愈伤组织，无菌滤纸吸去多余菌液， (4)选取生长良好的胚性愈伤组织然后置共培养培养基 共培养的培养基: 汕大量 B5微量 B5有机 B5铁盐 水解酪蛋白 300 mg/L 脯氨酸 500 mg/L 2, 4-D 2 g/L 蔗糖 30 g/L 20mg/L 乙（ 酰丁; 香酮,pH5.2o 抗性筛选: 共培养后，用无菌滤纸吸干多余水分后，将愈伤组织转移到选择培养基上，28、 黑暗下选择培养，培养时间3-4周。几天内注意观察，若愈伤周围有农杆菌生长, 将同皿的其它愈伤转到新的NBT+抗生素培养基 抗性筛选培养基： N6大量 B5微量 B5有机 B5铁盐 水解酪蛋白300 mg/L 脯氨酸 500 mg/L 2,4-D 2 g/L 蔗糖 30 g/L 潮霉素 50mg/L 头抱霉素 0. 5g/L 头抱霉素 0. 5g/L PI15. 8. 予分化培养 将表现出潮霉素抗性的愈伤组织转移到予分化培养基上，28黑暗培养 4-12do挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的潮霉素抗性愈伤组织转移到预分 化培养基上，28°C、黑暗下预分化培养2-3周（14-21天）。 B5微量B5 B5微量 B5有机 B5铁盐 6-BA 2 mg/L NAA 1 mg/L ABA 5 mg/L 水解酪蛋口 300 mg/L 脯氨酸 500 mg/L 蔗糖 30 g/L 潮霉素 50mg/L 头砲霉素 0. 5g/L N6大量 PH5. 8. 分化培养 选择奶白色，表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28C、光照下培养 50天 N6大量 B5微量 B5有机 B5铁盐 6-BA 3 mg/L NAA 0. 5 mg/L 水解酪蛋白300 mg/L 脯氨酸 500 mg/L 蔗糖 30 g/L 潮霉素 50mg/L 头砲霉素 0.5g/L PH5.8 生根培养 将从抗性愈伤组织再牛出的幼苗转移到根诱导培养基上，持续光照培养 15d.生长状况良好的幼苗直接转移到温室种植。 根诱导培养基的配方:ms培养基大量元素,微量元素和有机成分,30g/l蔗糖, 15g/l 琼脂,pH5. 8. 水稻转化程序 Table 4 The Procedure of Rice Transfbnnation 4~7大 3大 4?7周 2?3周 8?12天 4周 10?14天 愈伤预培养 选择I 选择11 预再生 再生 壮苗 移栽 再生株系 Callus Co-cultivation Selection I Selection II PRCT50 RCT （亢照） Trans-plant Regeneration Trans-fer (NB+Ag) (NBTH 50) (NBTH 50) （比照） I/2MS lines 30/5 3/6 6/6 7/7 21/7 3/8 1/9 15/9 19 另从第二批转化苗中挑选10个抗性株系，两批共保留29个抗性株系移栽入温室。