遗传学与生理学结合的方法.pptVIP

用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产 ;; ;②对所有的相关途径进行详细的代谢流量分析。这涉及到底物进入细胞的碳架物流量，流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量，以及代谢中间产物流出细胞的碳架物流量(the central and peripheral carbon fluxes)。还原力的流量(redox flux)及能量流量(energy flux)。;; ;; ; ; ; ;;;;; ;底物;; ; ;;图2.; ; ;; ;Glc; ; 该区包含可能有多达七个酶的参与，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、丙酮酸激酶(PK)、 草酰乙酸脱羧酶(OAADC)和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统(PTS)都已得到鉴定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(PEPS)已被假定存在。丙酮酸羧化酶(PC)的存在已得到代谢流量分析的实验数据的支持。; ;; ;;　　; 尽管连续培养得到的结果表明，赖氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。但在有效分泌的生理条件下，氨基酸生产菌一般都处于生长受限制的状态。; 然而，对于与生长限制相关的中心代谢(central metabolism)和外围代谢(peripheral metabolism)的改变如何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；这或许与影响到许多不同的基因和操纵子的调节网络(regulatory networks)的作用有关。;; 很显然，所使用的这些方法都对细胞质膜或细胞壁有一定影响，但使细胞膜通透性发生变化的机理是不完全一样的。;　　;;（1） 氨基酸的生产与菌体生长之间的关系尚未解决（耦合与否？）。;;; 例如，在过量生产某种产物的代谢条件下，已观察到某些特有的代谢中间产物，如 丙酮酸、α- 酮戊二酸等会大量分泌。这些特定的代谢中间产物先在细胞内累积(这取决于碳源的性质和生长限制)，然后分泌到细胞外(如果细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机构或有输送系统存在)，从而抵消在碳架物质、还原当量和代谢能等在代谢中的不平衡。;; ; ; ;; ;; ;Date; ;　　; ; ; ; ; ;;; 　;CO2;;; ; ; ;Date; ; 这一方面解释了所能获得的最大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜的透性常数，以及分泌和吸收载体的活力；另一方面，由此可看出在生产条件下可能发生由代谢能驱动的分泌与被动回流构成的无效循环是浪费代谢能的。; 一般说来，抵消氨基酸的产量的氨基酸的吸收系统对于整个过程并不重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，吸收系统的活力非常低。最近发现，芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的结果是相应氨基酸的吸收的增加，实际上产物的转化率降低了。总之，深入了解氨基酸吸收和分泌的能学及调控的机理对于定量地理解氨基酸的生产过程是极为重要的。; 在进行包括输送途径的代谢流量的详细分析时，特别是在比较野生株和生产菌株，或特定菌株在生产或非生产条件下的性质时，已引出了几个重要的概念。; 单靠“瓶颈” 酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。在通常情况下，仅仅是从底物到产物整条途径的某 “ 瓶颈 ” 酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。对生产菌株的分析表明，为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。只有当一系列酶发生了协调的改变，才能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或积压，避免代谢不平衡或不必要的副反应。 ; 用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酵母菌进行了有关芳香族氨基酸发酵成功的研究。关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌的代谢途径工程研究的成果已见发表。 ; 为提高色氨酸的产量，已对谷氨酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的遗传调节，包括：色氨酸操纵子(已被解除调节的)的基因的过量表达、去除调节子及弱化序列的控制；切断通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、增加前体物如PEP、E-4-P和丝氨酸等的供应、破坏色氨酸酶降解色氨酸的活性等等。;HMP; 虽然一般用于芳香族氨基酸生产的微生物并不是酿酒酵母，但在概念探讨方面，用酵母进