基因工程体外重组(带动画).pptVIP

第六章 DNA重组的操作 基因工程 外源DNA 载体DNA 重组分子 连接 ？ 1.基因文库 2.PCR 3.基因差异表达 第一节 DNA的体外重组 限制酶 —分子剪刀 限制酶 —分子剪刀 连接酶 —分子胶水 重组DNA分子 粘性末端连接效率最高！ 　 黏性末端　　　　 黏性末端 1、粘性末端的连接 第一节 DNA的体外重组 1. 粘性末端连接 创造互补粘性末端的方法有哪些？ 同种酶 同尾酶 第一节 DNA的体外重组 （1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 第一节 DNA的体外重组 　碱性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。 注意： 目的基因正反向插入； 载体与多个目的基因片段重组。 1 2 3 1 2 3 4 4 3 4 第一节 DNA的体外重组 　（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 　 两种不同的限制性内切酶 两端会产生非互补的突出端 定向重组体 第一节 DNA的体外重组 质粒载体的定向重组 碱性磷酸酶？ 避免了目的基因正反向插入 2. 平头末端连接 第一节 DNA的体外重组 平末端　　　平末端 SmaI限制酶 第一节 DNA的体外重组 　 　　 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 　　　 （1） 直接连接 第一节 DNA的体外重组 　（2） 人工加尾形成 “粘性末端” 　　 a）同聚加尾 法 　　　 DNA末端转移酶 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸, 利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 　　 第一节 DNA的体外重组 非酶切位点 　　 a）同聚加尾法 缺点：不能把插入片段再切下来。 第一节 DNA的体外重组 还有哪些方法能够创造粘性末端？ 第一节 DNA的体外重组 b）衔接物(linker)连接 　　　Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 　　 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker： 第一节 DNA的体外重组 衔接物(linker)连接 第一节 DNA的体外重组 衔接物(linker)连接 优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker 缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段 第一节 DNA的体外重组 c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter 第一节 DNA的体外重组 缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 防止自我连接： 先用碱性磷酸酶（CIP）处理接头 以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。 DNA接头 (adapter)连接法 平头末端连接 （1） 直接连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)衔接物连接 c) DNA接头连接法 小结 PCR? 第一节 重组DNA分子的构建 　3.PCR产物的连接 　（1）在引物的5’端设计酶切位点 GCAGAATTC 互补序列 3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列 （5’端多余的3~5bp属保护碱基） 引物 第一节 DNA的体外重组 引物1 　　GCAGAATTC 互补序列 模板 EcoRI位点 5’- -3’ GCAGAATTC 互补序列 5’- -3’ 3’ 模板 GCAGAATTC 互补序列 PCR产物 5’- -3’ 3’ 复性 延伸 模板 模板 3’ 第一节 DNA的体外重组 GCTAGCCGG 互补序列 模板 BamH I 位点 -5’ 3-’ 复性 延伸 模板 模板 3’ 3’ GCTAGCCGG 互补序列 3’- 模板 GCTAGCCGG PCR产物 互补序列 引物2 3’ 3’ 第一节 DNA的体外重组 BamH I EcoRI 质粒载体的定向重组 PCR 第一节 DNA的体外重组 　（2）与T载体直接连接 　Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3’端