猪常见病pcr检测程序.docVIP

猪 病 检 测 手 册 目录 TOC \o 1-1 \h \z \u 猪瘟RT-PCR检测程序 3 猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 5 高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 7 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序 9 猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序 11 猪细小病毒（PPV）PCR检测程序 13 猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）PCR检测程序 15 细菌学检测程序 17 猪瘟RT-PCR检测程序 一 、病毒RNA的提取 1、阳性对照RNA的提取 材料 冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。 方法 将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1ml RNase-free管分装，每管500μl，-20℃保存。取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用 2、疑似病料RNA的提取 样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附： 组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（PH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。 RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50μl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。 RT-PCR反应 1、材料 RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。 引物序列：F：5’-GACCTGGATGCGACTGACC-3’ , 19bp ，TM为61.88。 R：5’-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3’, 20bp，TM为59.85。扩增的目的片段为133bp。 RT体系及反应程序： 名称 弱毒疫苗阳性对照 检测病料 RNase-Free 水 6μl 0 特异性下游引物 1μl 1μl 模板RNA 5μl 11μl Total 12μl 12μl 置于PCR仪上65℃10min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂： 变性后的RNA溶液 12μl 5×RT buffer 4μl dNTP mixture 2μl RNase Inhibitor 1μl Rever TraACE 1μl Total 20μl 按以下程序反转录： 1、 42℃， 2、 99℃ 将cDNA -20℃保存。 PCR反应体系及程序 ddH2O 7.5μl cDNA 3μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl 2×Master mix 12.5μl Total 25μl 反应程序： 1、94℃， 2、95℃，30sec 3、56℃，30sec 4、72℃， 5、72℃， 三、电泳 用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5μl染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133bp的条带，判定为猪瘟病毒阳性。 猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 一 、病毒RNA的提取 1、阳性对照RNA的提取 材料 冻干PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。 方法 将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗用2ml生理盐水或PBS液稀释，用1ml RNAase-free管分装，每管200μl，-20℃保存。取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用 2、疑似病料RNA的提取 样品采集 病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附： 组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（pH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。 RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50μl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。 RT-PCR反应 1、材料 RT试剂盒（日本东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。 引物序列：F：5’