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男科实验室常用科研方法 陆金春 南京军区南京总医院 武警江苏总队南京医院 主要技术 免疫分析技术 荧光、酶、放射、发光、Western印迹、免疫组化等 PCR技术 芯片技术 基因芯片、蛋白质芯片 核酸分子杂交技术 电泳技术 基因差异显示技术 基因重组及蛋白质表达技术 流式细胞术、电镜及质谱技术等 免疫分析技术基本原理 利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法 抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。 抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的球蛋白。 免疫测定技术分类 均相法（Homogeneous） 免疫凝集法： 自然凝集：血型测定 肥达氏反应等 敏化凝集：血球凝集法 凝胶（微粒）比浊法等 免疫扩散法：单扩、双扩等 免疫电泳法 非均相法（Heterogeneous） 放射免疫法（RIA）、免疫放射法（IRMA）等 荧光免疫法（FIA） 酶联免疫法（EIA，ELISA） 化学发光法（LIA） 免疫印迹（Western-blot 免疫组织化学技术 金标法 组合技术：酶联荧光法（FEIA）、酶联化学发光法（ELIA）、时间分辨荧光法（DELFIA）、电化学发光法（ECLIA）等 双抗体夹心法（三明治法）原理 竞争法的原理 间接法原理 俘获法原理 双抗原夹心法原理 间接包被夹心法原理 几种标记/检测技术灵敏度的比较 发光检测技术的灵敏度及线性范围都已经接近了免疫反应的极限 片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱，不仅毫无意义，而且也是荒谬的 免疫学检测的瓶颈在于抗体亲合力和干扰免疫反应的因素，而不是检测技术 筛选抗体、屏蔽干扰，生产工艺、管理水平和技术服务是试剂生产的关键 几种标记/检测技术线性范围的比较 几种标记/检测试剂的有效期比较 免疫分析的干扰因素 Western blotting的概念 Western印迹、蛋白质印迹或免疫印迹法，这是一种用抗原抗体的特异性结合来检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术 基本步骤 将SDS电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与特异性的一抗进行反应； 洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入二抗（标记有酶、同位素或荧光）； 反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 蛋白转膜系统 转膜系统示意图 结果显示 免疫组织化学(Immunohistochemistry) 利用特异性抗体对组织中某种特异成份(抗原)进行抗原-抗体反应,达到检测组织细胞内是否有此特异性物质。其本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定组织细胞内的某种化学物质)。 应用与结果判定 用已知抗体探测未知抗原：受体、酶、递 质、肽类、细胞骨架蛋白等 用已知抗原探测未知抗体 结果判定:有阳性产物，说明细胞内有此物质， 但是否由此细胞产生不能完全肯定 定量:阳性细胞数、灰度值或光密度值 免疫组化操作步骤 1.组织标本制备：固定、包埋、切片 2.封闭：异种蛋白质间会有非特异性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白（BSA）封闭 3.与一抗孵育：最佳浓度需摸索，为提高抗体向组织内穿透，可在抗体稀释液中加入0.1%～0.3% TritonX-100。需长时间孵育时应加入0.01%～0.3% NaN3防腐 产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗 4.洗涤：去掉非特异性结合 5.与二抗孵育：浓度1:100~200，二抗必须针对一抗动物种属，二抗上结合的物质不同，显色用不同方法：ABC、PAP、荧光显色、IGSS（免疫金银染色法）。ABC、PAP经典、产物稳定；荧光法不需三抗，不需脱水透明，但荧光易淬灭；IGSS非常敏感，不用DAB做反应，但背景难以控制 6.与底物（DAB ）反应：DAB能致癌，在强光下可氧化（应尽量避光），6～8 min出现阳性产物，镜下控制反应 7.对照： 阴性对照：NGS 或缓冲液代替一抗； 去二抗； 吸附实验：将一抗与过量的抗原一起孵育一 段时间后，以此混合液再作免疫组化染色 阳性对照：已知含有待检物的某种组织 PBS洗片 → 0.5%~3%H2O2 15min(灭活内源性过氧化物酶) → PBS洗片 → 5％～10%NGS(或5％~10%BSA)+0.2%TritonX-100 孵育1~2h( 封闭) → 一抗