一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选-中国医药生物技术.PDF

470 中国医药生物技术 2014 年 12 月第 9 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2014, Vol. 9, No. 6 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.012 ·技术与方法· 一种基于 TIL 的肿瘤相关抗原特异性 T 细胞的筛选方法 吴凤麟，韦嘉灝，贾筠，何免，邵红伟，黄树林 [1] Wolfl 等 的研究建立了一种以 CD137 为表面标记， 1 材料与方法 从人 CD8+T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的 1.1 材料 + + + + 方法。由于 CD137 分子表达于活化的 CD4 和 CD8 T 细 1.1.1 样本 HLA-A2 AFP 肝癌患者腹水样本由东莞市 胞表面[2] ，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化， 人民医院肿瘤内科收集，患者签署知情同意书。抽取 并可在抗原刺激后 12 h ~ 5 d 内持续表达[3] 。因此可以 HLA-A2+ 健康志愿者外周血样本。 CD137 为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特 1.1.2 细胞株 人 TAP 缺陷 T2 细胞株为本实验室保 异性 T 细胞。 存。 上述研究主要从健康人外周血单核细胞（peripheral 1.1.3 主要试剂 RPMI 1640 培养基、胎牛血清为美国 blood monocyte ，PBMC ）中筛选 CD137+ 抗原特异性 T 细 Gibco 公司产品；人淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科 胞。然而由于成熟的外周血 T 细胞经历了胸腺的阴性选择， 技有限责任公司产品；重组人 IL-2 、IL-15 为美国 R D 其 T 细胞抗原受体（T cell receptor，TCR ）对自身抗原肽 公 司 产 品 ； HLA-A2 限 制 性 AFP218-226 表 位 9 肽 （接近肿瘤抗原肽）/MHC 复合物的亲和力低下[4] ，限制了 （LLNQHACAV ）由杭州中肽生化有限公司合成；PC5 标 以健康人 PBMC 筛选肿瘤抗原特异性 T 细胞的效率。因 记抗人 CD8 抗体、FITC 标记抗人 CD62L 抗体、PE 标 此，有必要寻找更理想的肿瘤抗原特异性 T 细胞筛选来源， 记抗人 CD44 抗体、ECD 标记抗人 CD45RO 抗体、PE 标 这一来源应较为确定地含有可识别肿瘤相关抗原的 T 细胞 记抗人 CD137 抗体均购自美国 BioLegend 公司；CD8 阴 亚群。 选磁珠试剂盒、CD62L 阳选磁珠试剂盒、CD137 阳选磁珠 国外临床研究结果提示，肿瘤局部浸润的记忆性 T 细 试剂盒均购自德国 Miltenyi 公司。 胞数量，与患者的预后和转归有明显相关性[5] 。提示肿瘤浸 1.2 方法 润记忆性 T 细胞可在局部识别肿瘤抗原进而发挥抗肿瘤免 1.2.1 腹水 TIL 分离 取新鲜抽取的 HLA-A2+AFP+ 肝 疫效应。尤其是记忆性 T 细胞中的中枢型记忆性 T 细胞 癌患者腹水样本，与无菌生理盐水按 1 :1