郑操实验体会模板.ppt

* 实 验 心 得 实验常见问题： 引物设计 基因和T载体的连接 基因片段与载体的酶切 基因片段与载体的连接与转化 跑蛋白胶时常见问题分析 蛋白表达与纯化 液相测活 检查基因内的酶切位点，避免与自己所使用的酶切位点重复（同尾酶、无缝克隆） 正向引物（照抄） 反向引物（反向互补） 可在引物的5’端加酶切位点和保护碱基，或其他目的序列 完全配对碱基数保证在15 nt以上 经验： 连T载不需加保护碱基； 直接连载体的话就需要加保护碱基，上网可以查到保护碱基表 ★引物设计 PCR过程 重叠延伸PCR的引物设计 原理：重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除、插入一段序列以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。 A B AB Fm Rm F R 基本步骤： 1. 引物设计 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物。 引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。 2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。 3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。 4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR。进行PCR约5-10轮即可。 5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。 A B AB Fm Rm F R MHEWGLSEELKIQTKQMIEIAEKELSIMRNAIDKEDECILCKMDIHHMLANVQTLAATYYIQAYLSPYTESSSFITTAIQHLSARKHGALIVVERNETLEALIQTGTTLNAHLTAPLLESIFYPGNPLHDGAVLVKNNHIVSAANILPLTKSTEVDPELGTRHRAAIGLSEKSDALILVVSEETGRTSFALNGILYTISL ATGCACGAATGGGGCTTGTCAGAAGAGCTCAAAATACAAACAAAGCAAATGATTGAAATTGCTGAAAAAG AACTATCGATTATGAGGAACGCAATCGATAAAGAAGACGAAGCTATTTTAGCTAAAATGGAAGATATTCA TCATATGTTAGCAAATGTACAAACATTGGCAGCTACATACTATATTCAGGCATATTTATCACCTTATACG GAAAGTTCATCTTTTATTACGACAGCTATCCAACACTTAAGCGCCAGAAAACATGGTGCTCTTATCGTTG TGGAAAGAAACGAGACGCTTGAAGCTCTCATTCAAACTGGAACGACATTAAACGCTCATTTAACTGCACC ATTACTCGAATCAATATTTTATCCAGGTAACCCTCTTCATGACGGTGCCGTTCTCGTAAAAAATAATCAT ATTGTCTCAGCTGCTAATATTCTTCCTTTAACGAAAAGTACAGAAGTTGATCCTGAGCTAGGAACACGTC ACAGAGCTGCAATTGGCTTATCAGAAAAGAGTGATGCACTTATATTAGTTGTCTCTGAAGAAACGGGCCG TACTTCTTTTGCTTTAAACGGGATTTTGTATACGATTTCTTTATAA ACGGAAAGTTCATCTTTTATTACGACAGCTATCCAACACTTAAGCGCCAGAAAACATGGTGCTCTTATCGTTGTGGAAAGAAACGAGACGCTTGAAGCTCTCATTCAAACTGGAACGACATTAAACGCTCATTTAACTGCACCATTACTCGAATCAATATTTTATCCAGGTAACC