碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒热稳定性法.docVIP

碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(热稳定性法) 简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。碱性磷酸酶同工酶有肝、骨、小肠、胎盘、胆汁等同工酶。 碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(热稳定性法)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过比色法(分光光度计或酶标仪)测定510nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出总的碱性磷酸酶活性水平。同时通过56℃、65℃加热后测定残余ALP活性，以确定同工酶的性质。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。如果用分光光度计，100T的检测试剂盒可检测25次左右；如果用酶标仪，100T的检测试剂盒可检测250次左右。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 编号 名称 TE0009 100T Storage 试剂(A): ALP Assay buffer 50ml 4℃ 避光 试剂(B): ALP显色液 50ml -20℃ 避光 试剂(C): 显色基液 150ml -20℃ 避光 试剂(D): Phenol标准(1mg/ml) 2ml RT 试剂(E): ddH2O 10ml RT 使用说明书 1份 自备材料： 离心管或96孔板 水浴锅或恒温箱 分光光度计或酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 配制标准品工作液：取出Phenol标准(1mg/ml)恢复至室温后，取溶解于ddH2O，使浓度达到，即为标准品工作液-Phenol(0.05mg/ml)。按照下表稀释系列标准品溶液。 0 1 2 3 4 5 Phenol(0.05mg/ml)(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ddH2O(ml) 0.55 0.45 0.35 0.25 0.15 0.05 相当于金氏单位(U/L) 0 10 20 30 40 50 准备样品： 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，冻存，用于碱性磷酸酯酶的检测。 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。 高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释后检测。 使用分光光度计检测： 检测总ALP：按照下表设置对照管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的碱性磷酸酯酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 对照管 标准管 测定管 Phenol标准(1～5号管) — 0.55 — 待测样品 — — 0.55 ALP Assay buffer 0.50 0.50 0.50 37℃水浴中孵育5min。 ALP显色液(37℃提前温育) 0.50 0.50 0.50 立即混匀，37℃水浴中准确孵育15min。 显色基液 1.50 1.50 1.50 待测样品 0.55 — — 检测ALP同工酶： 取相同样本，分别置于56℃和65℃水浴，准确孵育，期间不断晃动使温度尽快平衡，然后立即冰浴至室温。其余操作同上。 用分光光度计，以0号管(ddH2O)调零，读取对照管、标准管、测定管吸光度(即A对照、A标准、A测定)，如无法检测，亦可检测范围内吸光度，一般应数小时内检测完毕。 使用酶标仪检测： 检测总ALP：按照下表设置对照孔、标准孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的碱性磷酸酯酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行孔。 加入物(μl) 对照孔 标准孔 测定孔 Phenol标准(1～5号管) — 55 — 待测样品 — — 55 ALP Assay buffer 50 50 50 水浴中孵育。 ALP显色液(37℃提前温育) 50 50 50 立即混匀，水浴中准确孵育。 显色基液 150 150 150 待测样品 55 — — 检测ALP同工酶： 取相同样本，分别置于56℃和65℃水浴，准确孵育，期间不断晃动使温度尽快平衡，然后立即冰浴至室温。其余操作同上。 用酶标仪，以0号孔(ddH2O)调零，读取对照孔、标准孔、测定孔的吸光度(即