谷氨酸发酵培养基.pptVIP

生物素亚适量法生产谷氨酸 组员 李振国 芦敏 刘祺 陆姗姗 李雷达 董呈呈 万东 刘玉洋 一、实验目的 1、掌握谷氨酸发酵的原理 2、掌握谷氨酸种子制备的方法 3、掌握谷氨酸发酵过程中的条件控制 4、掌握谷氨酸发酵液提取谷氨酸的方法 5、掌握谷氨酸纯化的方法 6、探究不同糖浓度对菌种生长的影响 二、发酵原理 1.合成途径 　　谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。 在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。 发酵原理 2.发酵过程 　　在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：①氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。②温度。菌种生长的最适温度为30～32 ℃。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34～37 ℃。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0～8.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。发酵结束后，常用离子交换树脂法等进行提取。 三、实验试剂与仪器 试剂：葡萄糖?、尿素、硫酸镁、磷酸氢二钾、玉米浆、硫酸亚铁、硫酸锰、水解糖、玉米浆、K2HPO、MgSO4、尿素、FeSO4 2ppm、MnSO4、NaS、活性碳 仪器：500ml三角瓶2个、接种环、酒精灯、摇床、超净工作台、抽滤装置、烧杯、试管、发酵罐、离子交换柱、PH试纸或者PH计、1L量筒2个、200ml三角瓶5个、高压锅 操作步骤 1．一级种子培养工与制：按下列培养基配方配制1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121℃灭菌30min冷却备用。 葡萄糖?2.5%??????????? 尿素0.5%??????????? 硫酸镁0.04% 磷酸氢二钾0.1%???????? 玉米浆?? 2.5~3.5% 硫酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.0 2．一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的种子培养基中（250ml三角瓶内接入1~2环）于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养12h。一级种子质量要求： 种龄?12h????? pH6.4±0.1 光密度：净增O.D值0.5以上 无菌检查阴性，噬菌体检查无。 四、操作步骤 3．二级种子培养基配制：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121℃灭菌30min冷却备用。 水解糖2.5%???? 玉米浆2.5~3.5%????????? K2HPO4 0.15% MgSO4 0.04????? 尿素0.4%??????????????? FeSO4 2ppm MnSO4 2ppm????? pH 6.8~7.0 4．二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.5~1.0%接入上述已培养好的一级种子，于32℃±1℃、250r.p.m条件下培养7~8h，二级种子质量要求： 种龄7~8h???? pH 6.8~7.2?????? OD值净增0.5左右 无菌检查（一）、噬菌体无、残糖消耗1%左右 镜检生长旺盛，排列整齐，G+ 操作步骤 5．发酵培养基配制按下列培养基配方制发酵培养基，并按20%装液量分装于250ml三角瓶中，水解糖10%，甘蔗糖蜜0.18~0.22%，玉米浆0.1~0.15%，Na2HPO4 0.17%，KCl 0.12%、MgSO4 0.04%，用NaOH（5%）溶液调pH 7.20于110℃灭菌20min冷却备用。 6．发酵：按8~10%的接种量在发酵培养基中接入合格的二级种子注，于35℃±1℃、250 r.p.m条件下发酵35h