秋水仙素-安徽医科大学基础医学院.PPT

人类染色体标本的制备及G显带核型分析 安徽医科大学基础医学院生物学教研室 [目的和要求] 1. 掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。 2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带 染色体的核型分析技术。 [实验原理] 染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨（Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便，重复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。 核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体，并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。 染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断及研究中具有重要意义。 [实验用品] 1．器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温 培养箱、恒温水浴锅、10 ml刻度离心管、低 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。 2．材料：人外周静脉血。 3．试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、植 物血凝素（PHA）、秋水仙素(20μg/ml)、 0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、 固定液（甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、 Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液。 [实验步骤] (一)人类外周血染色体标本的制备 1．采集人外周静脉血1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。 2. 超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中，每 瓶加0.3～0.5 ml全血。轻轻混匀。 3. 37℃恒温培养箱静置培养72 h左右（培养24 h后水平 轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。 4. 培养至68～72 h（即终止培养前2～4 h），每瓶加秋 水仙素(20 μg/ml)至终浓度0.1～0.2 μg/ml，轻摇 培养瓶混匀，继续培养2～4 h。 5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10 ml玻璃离 心管，配平，1800 rpm 离心6 min。 6. 低渗 弃上清。加入37℃预温的0.075 mol/L氯化钾 8 ml，吸管轻轻吹打混匀，37℃低渗处理20 min。 7. 预固定 加入1ml 新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸 =3:1），轻轻混匀，1800 rpm 离心6 min。 8. 固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8 ml，轻轻混 匀，室温下静置固定20 min。 9. 弃上清，重复固定1次。 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定 液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 11.制片：取上述悬液1～2滴，滴至沾有冰水或干燥的 洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 12.37℃温箱放置3～4天或70℃烘烤2 h进行老化处 理，以备显带分析用。 【实验方法和步骤】 1、预处理：实验前3---4小时，取健康小鼠，每只 　　　　　　腹腔注射0．01％ 秋水仙素0．3---　 　　　　　　0．4ml。注意不要伤及内脏。 2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠 　　　　　　的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用 　　　　　　力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪　 　　　　　　刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股 　　　　　　骨，剔除上面的肌肉，洗净。 (三) G显带的核型分析 1.选取染色体分散良好、长度适中染色体G显带核型 照片，首先进行计数，然后将每条染色体剪下。 2.配对：同源染色体形态相同，带型一样；非同源染色体的大小，形态等带型各异，根据这个原理，按照染色体的大小、形态、着丝粒的位置，随体的有无和G显带带型等特征将46条染色体配成23对。 3.染色体排列：将配成23对的染色体按大小次序排列，一对性染色体排在最后，并把排列好的23对染色体分组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成 46,XX或46,XY。 人类染色体G-显带特征口诀： 一秃二蛇三蝶飘 四鞭炮五黑腰 六号是个小白脸 七上八下九苗条 十号长臂近带好 十一低来十二高 十三四十五 下、中、上 十六q2缢痕大 十七长臂带脚镣 十八人小肚皮大 十九一点腰 二十头重又脚轻 二十一象个葫芦瓢 二十二头带小黑帽 X一担挑，Y是黑脚 [注意