现代分子生物学-PCR常见问题原因分析及其对策-胡忠.pptVIP

PCR常见问题、原因分析及其对策 主讲内容 PCR标准反应体系 PCR标准反应体系 PCR常见问题 无扩增产物 PCR常见问题之一 无扩增产物 PCR常见问题之二 PCR常见问题之二 PCR常见问题之三 PCR常见问题之三 PCR常见问题之四 四种策略 巢式PCR（Nest-PCR） 策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） 策略之二 递减PCR（TouchDown PCR） 策略之三 热启动PCR （HotStart PCR） 策略之四 使用PCR增强剂 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 PCR技术简介 DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当 避免反复冻融 ddH2O pH值适当 避免污染 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP ddH2O 耐热聚合酶 如何选择最合适的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性 PCR 实验的不同需求 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 长片段扩增 PCR试剂盒 扩增效率 保 真 性 特 异 性 基因组扩增、RT-PCR 基因筛选、测序、 基因克隆 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） 构建基因图谱、测序、分子遗传学 复杂模板扩增、大规模基因检测 特异性 － 热启动 Taq酶 原 理 蜡封 抗体抑制 化学修饰 特 点 避免非特异性扩增 提高PCR反应的 特异性 用 途 基因组扩增 RT-PCR － 热启动 Taq酶 特异性 Promega：TaqBeadTM?HotStart 蜡封 Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum? Taq TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 抗体抑制 大大提高PCR反应的特异性 化学修饰不影响后续实验 天为时代: HotStart Taq Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start? DNA Polymerase Stratagene: SureStart? Taq 化学修饰 产 品 性 能 产 品 名 称 产 品 类 型 保真性 — 高保真酶 原 理 用 途 3’－5’核酸 表达基因的克隆 基因的定点突变 细胞内基因点突变分析（SNP） 外切酶活性 降低碱基错配率 保真性 — 高保真酶 性 能 比 较 生 物 公 司 产 品 类 型 Promega Tli DNA Polymerase TaKaRa PyrobestTM DNA Polymerase 在目前已发现的所有耐热聚合酶中, Pfu保真度最高碱基错配率最低 天为时代 Stratagene Promega Pfu DNA Polymerase 高保真 ＋ 高扩增效率 原 理 混合酶 －高扩增效率 － 3’－5’核酸外切 用 途 超长片段扩增 －测序 －构建基因图谱 复杂模板扩增 －GC含量高 －二级结构 高保真 ＋ 高扩增效率 特别适用于保真度较高的 超长片段扩增 保真度低于Pfu聚合酶 但扩增效率较高 天为时代：Long Taq TaKaRa：LA Taq Invitrogen：Elongase Amplificaiton System 长片段扩增 天为时代： Taq Platinum Invitrogen：Pfx Platinu