质粒的提取和纯化.pptVIP

质粒的提取和纯化 内 容 一.质粒的概念和提取原理 二.碱裂解法的实验操作和原理 三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理 四.实验室使用的方法 五.质粒纯化后的检测 一.质粒的概念和提取原理 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活 . 一.质粒的概念和提取原理 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control) 一.质粒的概念和提取原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验中使用的三个溶液 1,溶液Ⅰ： 葡萄糖—使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部. Tris.Cl (pH8.0)—提供反应的最佳环境. EDTA (pH8.0) —Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,抑制DNase(脱氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生长. 实验中使用的三个溶液 2,溶液Ⅱ：NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释) 1％ SDS 注:要新从浓NaOH稀释制备NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性. NaOH细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化,瞬间就溶解. 当然SDS也是碱性的,但是很弱,只能抽提得到少量质粒 . 实验中使用的三个溶液 3,溶液Ⅲ： KAc 冰醋酸 ddH2O 注:冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH. KAc是提供K+和SDS反应,取代Na离子,形成十二烷基硫酸钾 (PDS),而PDS是难溶于水的. SDS易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了 ,同时长长的基因组DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不与DNA分子结合 . 二，碱裂解法的操作步骤 1,取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液,高速离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2, 加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。 3,加入新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。 4,加用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。5,4℃下离心15分钟。  二，碱裂解法的操作步骤 6,取上清液,加入 RNA酶A, 37℃水浴20分钟。 7,加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下高速离心10分钟。 8,取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下高速离心10分钟。9,取上层水相,加入2倍体积的无水乙醇 ,室温放置几分钟 ,离心。 10,4℃下高速离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤,4℃下高速离心5分钟。 11,吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥 。 12,得到的质粒样品一般用TE缓冲液或者ddH2O进行溶解. 注意的事项 一,在加溶液Ⅱ后:①.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；②.必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。 二,加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净,否则对后面的实验有影响. 三,沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 四,提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提 . 三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤 （1） 将 2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为 15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在 37 ℃剧烈震荡（ 250rpm ）培养过夜。 （2） 将 1.5ml