基因工程的酶学基础.ppt

3. 多核苷酸激酶的用途 DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ （1）正向反应（forward reaction） -OH HO- 碱性 磷酸酶 碱性 磷酸酶 多核苷 酸激酶 多核苷 酸激酶 (?-32P)ATP 32P- -32P ADP，(?-32P)ATP ADP，(?-32P)ATP （2）交换反应标记法 反应混合物中具有超量(?-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(?-32P)ATP的?-32P与DNA5’端的磷酸交换。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ 反应效果不理想。 32P 32P T4多核 苷酸激酶 三、碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase，AP ） 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 (Bacterial AP，BAP) （1）细菌性碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 (Calf intestinal AP，CIP) 从小牛肠中纯化出来。 具有抗热性。 SDS中加热68oC可完全失活。 2. 碱性磷酸酶的活性 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ -OH HO- 碱性 磷酸酶 碱性 磷酸酶 3. 碱性磷酸酶的用途 单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。 AAGCTT TTCGAA HindⅢ酶切 A-OH TTCGA-P P-AGCTT HO-A 碱性磷酸酶 5’ 5’ （1）防止线性化的载体份子自我连接 A-OH TTCGA-OH HO-AGCTT HO-A OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。 但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。 A TTCGA AGCTT A AGCTT A A TTCGA 连接酶 -OH与-OH连不住 其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。 3’ P-AGCTT A-OH 5’ 3’ HO-A TTCGA-P 5’ 外源DNA 第五节 核酸外切酶（ Exonucleases） 是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 一、单链DNA外切酶 1. 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I） 5’?3’外切 识别5’-OH 2. 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 5’?3’、3’?5’外切 识别3’-OH、5’-P 二、双链DNA外切酶 1. 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 3’?5’外切 识别3’-OH 主要用途： 在DNA双链的末端产生出单链区域。 5’ 5’ 5’ 5’ 与klenow配合可以进行3’端标记 -OH HO- exo Ⅲ exo Ⅲ 2. ?核酸外切酶（? exo） 5’?3’外切。 主要用途： 使DNA双链变成单链（短）。 识别5’-P（但不能降解5’-OH） 5’ 5’ 5’ 5’ 可成为测序模板 -P P- ? exo ? exo 3. T7基因6核酸外切酶 5’?3’外切。 用途与? exo一样。 既能识别5’-P，又能识别5’-OH。 已被克隆到大肠杆菌中表达。 5’ 5’ 5’ 5’ T76 exo T76 exo DNA外切酶 切割方式 识别位点 单链 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I） 5’?3’ 5’-OH 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 5’?3’ 3’?5’ 5’-P 3’-OH 双链 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 3’?5’ 3’-OH ?核酸外切酶（ ? exo） 5’?3’ 5’-P T7基因6核酸外切酶 5’?3’ 5’-P 5’-OH 第六节 单链DNA内切酶 一、S1核酸酶 1. 来源 稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）。 2. 特性 （1）高度单链特异性 （2）反应条件 1）低水平Zn2+ 2）pH4.0~4.3 3. S1核酸内切酶的功能 （1）催化单链RNA或DNA降解。 （2）切掉双链核酸中的单链区。 （发卡或有缺口的部位）。 S1 S1 S1 但不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链 ATGCAT GCATGC TACGTA CGTACG T 甚至能识别单个核苷酸的单链区！ （3）降解限制酶切形成的单链突出端 S1 S1 S1 4. S1核酸酶的用途 （1）定位RNA DNA RNA S1 S1 200 bp 400 bp 某限制酶切后再与RNA杂交